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目的:随着女性生育年龄的推迟和生活方式的改变,不孕症呈现逐年上升的趋势,迄今为止,已经影响了全球约1/4的育龄女性。近年来随着生殖医学的不断进步,体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET）技术已广泛应用于临床不孕症的治疗。但有临床数据显示多数生殖中心首次临床妊娠率为40%-60%,其余大部分患者仍需采用重复控制性卵巢刺激（controlled ovarian stimulation,COS）来获得妊娠。有研究结果表明,随着重复COS周期数的增长,患者卵巢储备功能、卵子数量及卵子质量等指标均呈下降趋势改变。且重复COS会造成卵巢中氧化损伤产物的堆积,影响颗粒细胞和卵泡液的正常功能,进而影响患者的临床妊娠率。补肾法是中医治疗不孕症的重要方法,补肾调经方是导师临床治疗肾虚不孕的经验方。本研究目的在于通过临床研究和细胞实验来观察补肾法对重复COS患者卵泡液及颗粒细胞抗氧化应激能力的影响;通过临床病例数据来观察补肾法对重复COS患者临床妊娠结局的影响。方法:采用随机双盲设计方法,将符合纳排标准的重复COS（2-4次）患者分为安慰剂组（30例）和补肾组（30例）,另外将因输卵管因素首次接受IVF-ET的患者作为对照组（30例）。安慰剂组和补肾组患者均于末次移植失败后月经第5天服用药物3个月经周期后再行控制性卵巢刺激（3-5次）,治疗结束后观察患者的临床妊娠结局指标（基本情况、性激素水平、Gn用量、获卵数、受精率、优质胚胎率和临床妊娠率）。临床研究:所有重复COS（3-5次）患者均应用拮抗剂方案,注射HCG 36-38h后在阴道B超指引下进行穿刺取卵术,留取优势卵泡之卵泡液和颗粒细胞。将含有颗粒细胞的卵泡液进行分离并提取,置于-80℃冰箱保存。应用ELISA法检测卵巢颗粒细胞及卵泡液中ROS含量、氧化损伤产物AOPP、3-NT、及4-HNE的含量;抗氧化酶NQO1的活力及T-AOC。使用RT-PCR法检测抗氧化酶NQO1的m RNA表达情况。细胞实验:将因输卵管因素首次行IVF-ET患者的颗粒细胞进行收集,并分为3组培养。（1）正常组:正常培养液培养48h;（2）模型组:在正常组培养的基础上,添加0.75mmol/l浓度H2O2后再培养2h;（3）补肾组:正常培养液培养24h,更换含20%补肾调经方含药血清的培养液培养24h后添加0.75mmol/l浓度H2O2后再培养2h。应用ELISA法检测卵巢颗粒细胞中ROS含量、氧化损伤产物AOPP、3-NT及4-HNE的含量;抗氧化酶NQO1的活力及T-AOC。使用RT-PCR法检测抗氧化酶NQO1的m RNA表达情况。结果:1.对照组、安慰剂组、补肾组患者一般情况比较:三组患者的年龄、BMI、不孕年限、基础性激素水平及AMH比较均无统计学差异（P＞0.05）。与对照组比较,安慰剂组和补肾组的基础窦卵泡数均明显降低（P＜0.05）。2.对照组、安慰剂组、补肾组患者临床妊娠结局指标比较:三组患者Gn使用总量、受精率比较均无统计学差异（P＞0.05）。与对照组比较,安慰剂组的获卵数、优质胚胎率和临床妊娠率均明显降低（P＜0.05）;与安慰剂组比较,补肾组的优质胚胎率和临床妊娠率均明显升高（P＜0.05）。3.对照组、安慰剂组、补肾组卵巢颗粒细胞和卵泡液中ROS含量比较:与对照组比较,安慰剂组和补肾组卵巢颗粒细胞ROS含量均明显升高（P＜0.05）;与安慰剂组比较,补肾组卵巢颗粒细胞ROS含量明显降低（P＜0.05）。与对照组比较,安慰剂组和补肾组卵泡液中ROS含量均明显升高（P＜0.05）。4.对照组、安慰剂组、补肾组卵巢颗粒细胞和卵泡液中AOPP、3-NT和4-HNE含量比较:（1）与对照组比较,安慰剂组和补肾组卵巢颗粒细胞AOPP含量均明显升高（P＜0.05）;与安慰剂组比较,补肾组卵巢颗粒细胞AOPP含量明显降低（P＜0.05）。与对照组比较,安慰剂组和补肾组卵泡液中AOPP含量均明显升高（P＜0.05）;与安慰剂组比较,补肾组卵泡液中AOPP含量明显降低（P＜0.05）。（2）与对照组比较,安慰剂组和补肾组卵巢颗粒细胞3-NT含量均明显升高（P＜0.05）;与安慰剂组比较,补肾组卵巢颗粒细胞3-NT含量明显降低（P＜0.05）。与对照组比较,安慰剂组卵泡液中3-NT含量明显升高（P＜0.05）。（3）与对照组比较,安慰剂组卵巢颗粒细胞4-HNE含量明显升高（P＜0.05）。与对照组比较,安慰剂组卵泡液中4-HNE含量明显升高（P＜0.05）。5.对照组、安慰剂组、补肾组卵巢颗粒细胞和卵泡液中抗氧化酶NQO1活力和T-AOC的比较:（1）与对照组比较,安慰剂组和补肾组卵巢颗粒细胞抗氧化酶NQO1活力均明显降低（P＜0.05）。与对照组比较,安慰剂组卵泡液中抗氧化酶NQO1活力明显降低（P＜0.05）。（2）与对照组比较,安慰剂组卵巢颗粒细胞T-AOC明显降低（P＜0.05）;与安慰剂组比较,补肾组卵巢颗粒细胞T-AOC明显升高（P＜0.05）。与对照组比较,安慰剂组卵泡液中T-AOC明显降低（P＜0.05）;与安慰剂组比较,补肾组卵泡液中T-AOC明显升高（P＜0.05）。6.对照组、安慰剂组、补肾组卵巢颗粒细胞抗氧化酶NQO1的m RNA表达水平比较:RT-PCR结果显示,与对照组比较,安慰剂组卵巢颗粒细胞抗氧化酶NQO1的m RNA表达水平明显降低（P＜0.05）;与安慰剂组比较,补肾组卵巢颗粒细胞抗氧化酶NQO1的m RNA表达水平明显升高（P＜0.05）。7.正常组、模型组、补肾组卵巢颗粒细胞ROS含量比较:与正常组比较,模型组和补肾组卵巢颗粒细胞ROS含量均明显升高（P＜0.05）;与模型组比较,补肾组卵巢颗粒细胞ROS含量明显降低（P＜0.05）。8.正常组、模型组、补肾组卵巢颗粒细胞AOPP、3-NT和4-HNE含量比较:（1）与正常组比较,模型组卵巢颗粒细胞AOPP含量明显升高（P＜0.05）;与模型组比较,补肾组卵巢颗粒细胞AOPP含量明显降低（P＜0.05）。（2）与正常组比较,模型组卵巢颗粒细胞3-NT含量明显升高（P＜0.05）;与模型组比较,补肾组卵巢颗粒细胞3-NT含量明显降低（P＜0.05）。（3）与正常组比较,模型组卵巢颗粒细胞4-HNE含量明显升高（P＜0.05）;与模型组比较,补肾组卵巢颗粒细胞4-HNE含量明显降低（P＜0.05）。9.正常组、模型组、补肾组卵巢颗粒细胞抗氧化酶NQO1活力和T-AOC的比较:（1）与正常组比较,模型组卵巢颗粒细胞抗氧化酶NQO1活力明显降低（P＜0.05）;与模型组比较,补肾组卵巢颗粒细胞抗氧化酶NQO1活力明显升高（P＜0.05）。（2）与正常组比较,模型组卵巢颗粒细胞T-AOC明显降低（P＜0.05）。10.正常组、模型组、补肾组卵巢颗粒细胞抗氧化酶NQO1的m RNA表达水平比较:与正常组比较,模型组卵巢颗粒细胞抗氧化酶NQO1的m RNA表达水平明显降低（P＜0.05）;与模型组比较,补肾组卵巢颗粒细胞抗氧化酶NQO1的m RNA表达水平明显升高（P＜0.05）。结论:1.重复COS可以降低不孕症患者的获卵数、优质胚胎率及临床妊娠率,而加用补肾调经方后可以提高重复COS患者的胚胎质量,提高重复COS患者的临床妊娠率。2.重复COS可以导致氧化损伤产物的增加,造成卵巢颗粒细胞的氧化应激状态,而补肾调经方可以减少氧化损伤产物的堆积,提高抗氧化酶的活性,有效改善卵巢氧化应激状态。3.H2O2可造成卵巢颗粒细胞氧化应激状态,而加用补肾调经方含药血清后可以有效缓解卵巢颗粒细胞的氧化应激状态。