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目的:在全世界范围内,心肌梗死(Myocardial Infarction,MI)存在高患病率和高死亡率的特点,尤其是老龄人群。近年来,大量的动物实验和临床试验证实间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)移植对MI有良好的治疗效果,逐渐成为了医学领域研究热点。目前,MSCs治疗MI以自体移植为主。然而对于MI这一与年龄相关疾病而言,MSCs的整体质量随着患者本身的年龄增长出现衰老,导致功能下降。因此,对来源于老年人的骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived MSCs,BMMSCs),在体外进行改造增强其功能具有重要意义。本课题目的在于:首先检测老年志愿者来源的BMMSCs(agedMSCs,AMSCs)的衰老状态;接着证明衰老的AMSCs存在线粒体融合裂变失衡;检测micro RNA-155-5p(mi R-155-5p)与AMSCs的关系以及mi R-155-5p表达是否可能通过作用于线粒体融合裂变稳态参与AMSCs衰老;证明mi R-155-5p主要作用于Cab39/AMPK信号通路引起AMSCs衰老;最后在MI小鼠模型中验证抑制AMSCs中mi R-155-5p表达是否能够提高其对MI的治疗作用,为衰老的MSCs进行改造提供新的靶点。方法:根据实验目的的不同,我们选用不同的实验方法进行实验。(1)首先我们先检测AMSCs是否出现了衰老。分别选取老年志愿者和年轻志愿者来源的新鲜骨髓,原代培养出MSCs后,利用流式细胞术进行MSCs相关标志物鉴定。干细胞成骨和成脂诱导分化实验检测两组MSCs的分化能力;CCK8(Cell Counting Kit-8)实验、Ki67实验检测增殖能力;划痕实验检测迁移能力;微管形成实验(tube formation assay)检测两组细胞分泌血管生成相关因子的能力差异;累计群体倍增数(Cumulative population doubling)实验、SA-β-半乳糖苷酶(senescence associatedβ-galactosidase,SA-β-gal)染色及衰老相关蛋白检测两组细胞的衰老程度。(2)第二步,检测AMSCs是否出现线粒体融合裂变失衡。Mitotracker染色后在共聚焦显微镜下观察年轻志愿者来源的MSCs(young-MSCs,YMSCs)及AMSCs线粒体形态差异及电镜下观察两组MSCs的线粒体长度差异,在蛋白水平证明线粒体裂变相关蛋白——线粒体动力相关蛋白(dynamin-related protein 1,Drp1)和线粒体融合相关蛋白——线粒体融合蛋白2(mitofusin2,Mfn2)在两组MSCs表达的差异。(3)接着我们验证mi R-155-5p与AMSCs衰老之间的关系,以及mi R-155-5p是否可能通过作用于线粒体融合裂变稳态参与AMSCs衰老。使用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,q RT-PCR)检测老年志愿者与年轻志愿者来源的血清以及两组MSCs中mi R-155-5p含量差异。分别使用mi R-155-5p mimic处理YMSCs以及使用mi R-155-5p inhibitor处理AMSCs后,检测两组细胞增殖能力、分泌血管生成相关因子的能力差异及衰老程度。分别使用Mfn2 si RNA处理mi R-155-5p mimic干预后的YMSCs及线粒体分裂抑制剂(Mitochondrial Division Inhibitor 1,Mdivi-1)处理mi R-155-5p inhibitor干预后的AMSCs,验证mi R-155-5p是否通过影响线粒体融合裂变平衡引起AMSCs衰老。(4)mi R-155-5p通过作用于线粒体融合裂变稳态参与AMSCs衰老主要作用的信号通路是什么是我们下一步的研究内容。信号通路上,在Target Scan网站找到mi R-155-5p及钙结合蛋白39(Calcium-binding protein 39,Cab39)具有相互作用位点后,使用荧光素酶报告基因检测实验(luciferase assay)及蛋白水平进一步检测在MSCs衰老中mi R-155-5p与Cab39的关系。使用AMP依赖的蛋白激酶(Adenosine 5’-monophosphate(AMP)-activated protein kinase,AMPK)的激动剂AICAR(5-Aminoimidazole-4-carboxamide 1-β-D-ribofuranoside)处理由mi R-155-5p mimic干预后的YMSCs验证Cab39/AMPK信号通路是否参与mi R-155-5p引起MSCs衰老。(5)最后我们通过体内实验验证抑制mi R-155-5p表达是否可以提高AMSCs对于MI的治疗作用。通过对MI小鼠模型心肌注射YMSCs、AMSCs及mi R-155-5p inhibitor干预后的AMSCs(anti-mi R-155-5p AMSCs),人来源核抗原(Human Nuclear Antigen,HNA)免疫荧光染色情况检测MSCs在心肌组织中存活情况;TUNEL(Td T-mediated d UTP Nick-End Labeling)染色实验检测小鼠心肌细胞凋亡情况即验证MSCs发挥抗凋亡作用强弱;α平滑肌肌动蛋白(Alpha-smooth muscle actin,αSMA)免疫组化及CD31免疫组化检测心脏血管生成能力即检测MSCs分泌血管生成相关因子的能力。组织切片Masson染色观察小鼠心肌梗死的范围;超声下检测小鼠的左室射血分数(Left Ventricular Ejection Fraction,LVEF)及小鼠的左室短轴缩短率(Left Ventricular Fractional Shortening,LVFS)。结果:(1)与YMSCs相比,AMSCs出现增殖、迁移能力下降,分泌血管生成相关因子的能力下降,AMSCs出现衰老。(2)AMSCs中存在线粒体过度融合,线粒体融合裂变失衡的情况。(3)Mi R-155-5p在老年人血清中及AMSCs中表达量升高。在YMSCs中过表达mi R-155-5p可以引起YMSCs衰老,使YMSCs的增殖能力、分泌血管生成相关因子的能力下降。抑制mi R-155-5p在AMSCs中的表达可以延缓AMSCs衰老,提高AMSCs的增殖能力、分泌血管生成相关因子的能力。使用Mfn2 si RNA可以延缓由于mi R-155-5p表达引起的YMSCs衰老,说明mi R-155-5p表达引起的YMSCs衰老主要是通过使线粒体融合增加导致线粒体融合裂变失衡引起的。与单独使用mi R-155-5p inhibitor处理AMSCs组相比,同时使用线粒体裂变抑制剂Mdivi-1及mi R-155-5p inhibitor处理AMSCs后AMSCs衰老程度增加,说明抑制mi R-155-5p使AMSCs年轻化的效果是通过使AMSCs线粒体裂变增加,维持AMSCs的线粒体融合裂变稳态而完成的。(4)Cab39与mi R-155-5p具有相互作用关系,且Cab39及p-AMPK表达量在AMSCs中表达量下降。AMPK信号通路激动剂AICAR处理由mi R-155-5p mimic干预后的YMSCs,通过作用于Cab39/AMPK信号通路,使Cab39及AMPK表达量上升从而引起AMPK下游p-Drp1表达量上升及Mfn2表达量下降而使因mi R-155-5p表达引起的过度线粒体融合向线粒体裂变转换,线粒体融合裂变恢复平衡,进而可以延缓MSCs衰老。即mi R-155-5p引起YMSCs衰老的机制是mi R-155-5p抑制Cab39/AMPK信号通路表达,使线粒体融合裂变失衡,YMSCs衰老。(5)与注射AMSCs相比,注射anti-mi R-155-5p-AMSCs在MI模型小鼠上表现为:注射MSCs 28天以后,MSCs细胞存活率更高,TUNEL染色显示凋亡的心肌细胞更少,CD31及αSMA染色示小鼠心脏形成微血管的能力增强;Masson染色显示心肌梗死范围更小,LVEF及LVFS恢复至更高水平。以上结果说明抑制了mi R-155-5p的AMSCs旁分泌作用增强,分泌血管生成相关的因子、抗凋亡因子等的能力增加,具有增强的治疗MI的作用。结论:与YMSCs相比,AMSCs出现衰老;AMSCs中存在线粒体融合裂变失衡;mi R-155-5p升高与AMSCs衰老相关,mi R-155-5p通过影响线粒体融合裂变平衡引起AMSCs衰老;mi R-155-5p升高抑制Cab39的表达,进而抑制AMPK信号通路的激活导致线粒体裂变减少,融合增强影响线粒体蛋白稳态诱导MSCs衰老;使用mi R-155-5p的抑制剂处理AMSCs,激活Cab39/AMPK信号通路,调节线粒体蛋白稳态的失衡,使衰老的MSCs年轻化,增加其旁分泌功能,增强其对MI的治疗作用。