间充质干细胞（MSCs）存在于几乎所有的组织中,现已从骨片、骨髓、脂肪组织、脐带、胎盘和羊膜液等分离出。它能够分化成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。近年来研究发现MSCs拥有强大的免疫调节能力和治疗多种炎症相关疾病潜能。它们能抑制T细胞增殖、B细胞分化、NK细胞毒性以及树突细胞成熟。虽然有报道MSCs通过吲哚胺2、3-双加氧酶（IDO）,诱导性一氧化氮合酶（iNOS）,前列腺素E2（PGE2）,TGFβ以及PD-L1等在内的多种分子调节免疫,但其详细机制目前还不十分清楚,这就严重掣肘了特别是自身免疫性疾病和动物繁育障碍的干细胞疗法发展。SOCS1作为一种重要的细胞因子负反馈调节子,以负反馈方式来调控IFN γ、IFN a、IL-10等在内的多种细胞因子信号通路。当细胞因子过多时,SOCS1表达就会上调,通过JAK/STAT信号通路来抑制异常细胞因子产生。树突细胞是专职的抗原递呈细胞,在维持自身抗原耐受和激活先天及适应性免疫方面具有关键的调节作用。先前研究表明SOCS1能在树突细胞中被诱导,干扰SOCS1能增强树突细胞的抗原递呈和抗原特异的抗肿瘤免疫。下调树突细胞SOCS1能够允许更多的信号传递到T细胞,并且导致记忆T细胞群体的扩张。由于MSCs对促炎症细胞因子有反应,并且调节免疫细胞,所以推测SOCS1可能在MSCs的免疫调控功能中扮演重要作用。为此,我们开展了以下实验。实验一 SOCS1对MSCs基本生物学特性的影响SOCS1作为一种细胞因子负反馈调节因子,它能够影响免疫细胞的发育,但对于MSCs的基本生物学特性有何影响目前还未见报道。本实验中,我们利用带有绿色荧光蛋白（GFP）的慢病毒感染MSCs,建立了 SOCS1干扰的MSCs,并进行如下实验:1)通过荧光显微镜和流式细胞术分析GFP的表达,结果显示几乎所有的MSC/SOCS1sh组和MSC/CTLsh组都表达GFP,这说明感染成功。2)对其进行实时荧光定量RT-PCR和Western blot检测,结果显示MSC/SOCS1sh组SOCS1的表达比MSC/CTLsh组低,表明SOCS1基因已得到有效敲除。3)通过流式细胞术测定SOCS1干扰的MSCs表型,结果显示MSC/SOCSlsh组和MSC/CTLsh组没有差异,表明SOCS1不影响MSCs的表型。4)通过血细胞板计数、CCK8及BrdU标记法检测MSCs增殖能力,MSCs在SOCS1干扰后,增殖速度未见差异,表明SOCS1对MSC1的生长没有影响。5)通过成骨、成脂分化实验,也未见SOCS1干扰后对MSCs分化出现明显变化,说明它对MSCs的分化也没有影响。以上结果说明,SOCS1不影响MSCs表型、增殖及分化等生物学特性。实验二SOCS1在MSCs调控T细胞中的作用及其机制研究我们先前的研究表明,SOCS1对MSCs表型、增殖及分化等生物学特性没有影响,但对其免疫调控功能是否有影响呢?对此,开展以下实验:1)首先检测MSCs在炎症因子刺激下SOCS1是否也是上调。分别用2 ng/ml IFNγ/TNF a刺激小鼠原代MSCs及MSCs细胞系C3H10T1/2 12h和24h,以及分别用不同浓度 IFN γ/TNF α刺激 C3H10T1/2,用 real-time PCR 和 western blot 来评定SOCS1表达。所有这些数据都表明原代MSCs和MSCs细胞系在炎症因子刺激下SOCS1是显著上调的。2)T细胞用CFSE染色并用PMA和ionommycin刺激,然后与不同比率（MSCs:T=1:10,1:20,1:40,1:80）的 MSC/SOCSlsh 和 MSC/CTLsh 培养。结果显示T细胞增殖被MSC/CTLsh和MSC/SOCSlsh抑制,但MSC/SOCSlsh展示更强的免疫抑制活性。这表明SOCS1干扰后,促进MSCs抑制T细胞增殖。3)检测SOCS1干扰MSCs在小鼠黑色素瘤模型中的作用。B16-FO黑色素瘤细胞与MSC/SOCSlsh or MSC/CTLsh联合注入小鼠皮下,16天后,肿瘤称重。发现MSC/SOCSlsh和MSC/CTLsh都能促进肿瘤生长,但MSC/SOCSlsh表现出更强的效果。随后进一步检验它在DTH反应中的免疫抑制效果。OVA免疫的小鼠用OVA单独或OVA结合MSC/SOCSlsh或MSC/CTLsh注射小鼠足垫,通过测量足垫厚度来评价DTH反应。施加MSC/CTLsh能够降低炎症。MSC/SOCSlsh表现出更强的免疫抑制作用,足垫增厚表现快速降低。总之,敲低SOCS1的MSCs在体内外显示出更强的免疫抑制能力。4)通过 real-time PCR 和 western blotting 来检测 SOCS1 敲低后 MSCs iNOS的表达。结果显示在MSC/SOCSlsh中iNOS mRNA和iNOS蛋白表达显著增加。炎症因子刺激MSC/SOCSlsh and MSC/CTLsh,其上清液用于测定NO浓度。结果表明SOCS1敲低后,NO生成显著增加。为了进一步证实MSC/SOCSlsh免疫抑制是否具有NO依赖性方式,我们添加iNOS抑制剂NG-monomethyl-L-arginine acetate salt（L-NMMA）来测定T细胞增殖。在共培养测定中,L-NMMA完全恢复T细胞增殖。因此,SOCS1可能通过抑制iNOS表达及NO产生来削弱MSCs免疫抑制能力。5)近来研究表明RA患者的炎症关节中产生NO。我们数据也显示与OA患者关节液相比,RA患者的NO产生升高了 2-5倍。然后检测从RA患者关节液中分离出的MSCs（RAMSC）是否促进NO升高,与健康供体骨髓来源的MSCs（BMMSC）和关节炎患者关节液来源的MSCs（OAMSC）相比,在炎症因子刺激后,RAMSC分泌NO,我们没有检测到BMMSC分泌NO。进一步检测RAMSC中SOCS1表达,与OAMSC相比,RAMSC的SOCS1 mRNA显著降低。实验三SOCS1调节MSCs对B细胞增殖、活化及向浆细胞分化的影响我们先前的研究表明,SCOS1干扰的MSCs对T细胞增殖具有抑制作用,那么作为免疫系统里的重要一员,B细胞是否也会受到SCOS1干扰的MSCs的影响呢?1)采用CFSE标记从脾中来源的B220+B细胞,与MSCs共培养,分别用LPS、LPS/IL-4或LPS/TGFβ 1三组因子刺激,结果显示无论哪一组刺激,B细胞增殖在MSC/SOCS1sh组都比MSC/CTLsh组中低,这说明SOCS1下调后,能够促进MSCs抑制B细胞的体外增殖。2)同样也分别用LPS、LPS/IL-4或LPS/TGFβ 1三组因子刺激,两种MSCs与B细胞比例梯度（MSCs:B=1:10;1:40）的共培养,研究B细胞CD40、CD80的表达情况。结果显示,在三组刺激下,无论是MSC/SOCS1sh组还是MSC/CTLsh组,B细胞CD40、CD80表达都没有明显变化,且与单独B细胞培养的结果一样,说明SOCS1对MSCs调节B细胞活化没有影响。3)B细胞分别用LPS、LPS/IL-4和LPS/TGFβ 1刺激23h,然后单独或与MSC/CTLsh or MSC/SOCS1sh按照不同比例（MSCs:B cells）共培养。2天后,收集B细胞并标记抗小鼠B220、CD138抗体,用流式细胞仪检测B220、CD138表达来确定B细胞向浆细胞的分化。结果显示,无论哪种刺激,单独B细胞培养组的CD138百分率都比MSCs共培养组低,说明与MSCs培养促进了 B细胞向浆细胞的生成。但在 LPS 或 LPS/TGFβ 的刺激下,MSC/SOCS1sh 和 MSC/CTLsh 组的 CD138+B 细胞百分比之间没有明显差异,然而在LPS/IL-4刺激组,MSC/SOCS1sh组CD138+B细胞百分比（1:10组45.9%;1:40组30.4%）明显比MSC/CTLsh的（1:10组33.8%;1:40组28.4%）多。这表明SOCS1对MSCs调节B细胞向浆细胞分化的作用具有刺激因子种类依赖性。结论:我们结果表明MSCs中的SOCS1能被炎症因子所诱导表达,MSCs的SOCS1干扰未造成其表型、增殖与分化的明显差别,但却增强其免疫抑制能力。表现为:体外抑制T、B细胞增殖,不影响B细胞活化,不抑制B细胞向浆细胞分化并具有刺激因子种类依赖性;在体内能够显著促进肿瘤生长和抑制迟发型超敏反应。我们的研究进一步表明,SOCS1通过调控iNOS表达来抑制MSCs的免疫抑制能力。此外,我们发现,从风湿性关节病患者的关节液中分离出的MSCs,SOCS1低表达,同时NO生成多。总之,本研究揭示了 SOCS1在调节MSCs免疫调控中的一个以前未被认知的新作用。