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[目的]
利用合成抗原GST-AIB1-N和GST-AIB1-C分别免疫BALB/c小鼠，采用传统的单抗制备技术，制备分别针对AIB1蛋白氮端和碳端的单克隆抗体，生物素标记其中的一株抗体，构建双抗体夹心ELISA方法，探讨其在AIB1蛋白检测中的应用价值。
[方法与结果]1．利用合成抗原GST-AIB1-N和GST-AIB1-C分别免疫：BALB/c小鼠，采用传统的杂交瘤制备技术，获得1株能稳定分泌抗AIB1-N单克隆抗体的杂交瘤细胞株和1株能稳定分泌抗AIB1-C单克隆抗体的杂交瘤细胞株。采用体内扩增法获得了含大量特异性抗体的腹水，通过系列浓度梯度饱和硫酸胺初步纯化，透析除盐，再使用 Protein GSepharose 4 Fast Flow亲和层析柱进一步纯化，得到高纯度优质抗体。通过Westem-blot法鉴定抗体的特异性，免疫双扩鉴定其亚类，间接ELISA法测定其效价。经鉴定亚类均为IgG1型，1A2E1效价为1：409600；489F12效价为1：102400，Westem-blot结果发现1A2E1和489F12分别可以特异性识别靶细胞T47D中AIB1蛋白，与载体蛋白及BSA无交叉反应。
2.用生物素N-羟基丁二酰胺酯(BNHS)对纯化抗体1A2E1进行标记，获得了Biotin-1A2E1，标记抗体效价为1：3200。应用生物素-亲和素系统，对靶细胞中AIB1的检测进行了初步探讨。免疫细胞化学结果显示实验组细胞呈阳性表达，免疫荧光结果实验组肿瘤细胞显示荧光表达强，而对照组均为阴性。 3.抗AIB1双单克隆抗体夹心EIASA方案的构建：应用抗AIB1-C单克隆抗体489F12作为固相抗体，Biotin-1A<,2>E<,1>作为标记抗体，ELISA双抗体夹心法检测AIB1。试剂盒构建及优化的内容包括：最适包被浓度、最适包被缓冲液的选择、生物素标记抗体工作浓度的选择；试剂盒鉴定的指标包括敏感性、特异性、稳定性等。实验数据显示，使用0.05MpH9.6CB(碳酸盐缓冲液)为包被缓冲液，包被抗体489F12工作浓度为10μ g/m ，Biotin-1A<,2>E<,1>工作浓度选择1：500。
[结论]
1.成功制备抗AIB1-N和抗AIB1-C单克隆抗体。
2.成功标记生物素化抗体Biotin-1A2E1，并可初步应用于靶细胞AIBl蛋白的检测，提示该抗体可望在肿瘤辅助诊断中发挥作用。
3.双抗体夹心EIASA试剂盒方案的构建、鉴定达到了预期目的，为下一步临床研究奠定了基础。