研究目的:O-GalNAc糖基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰,它广泛地参与细胞的增殖与凋亡、迁移与侵袭、器官和个体的发育以及疾病的发生发展过程,然而人们对其在神经系统发育中的作用却知之甚少。多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族pp GalNAc-Ts是O-GalNAc糖基化的起始酶,该酶家族在哺乳动物中有20个成员。我们实验室的前期工作克隆了pp GalNAc-T13基因,并发现其在神经系统中特异性表达,但其具体功能尚不清楚。本研究第一部分中,我们运用体内外神经元分化模型,结合分子生物学和生物化学手段探索pp GalNAc-T13在神经发育中的作用。第二部分中,我们运用蛋白质组学的方法系统分析敲除pp GalNAc-T13对神经元分化过程中分泌蛋白糖基化的影响。第三部分中,我们构建了Galnt13的神经特异性和全身敲除小鼠,并对其表型进行初步的观察分析。实验设计:第一部分:通过蛋白质免疫印迹和细胞免疫荧光技术分析神经元分化过程中pp GalNAc-T13的表达和细胞分布情况。运用CRISPR-Cas9技术敲除pp GalNAc-T13后考察其对神经元分化和底物蛋白PDPN糖基化的影响。结合HPLC、MALDI-TOF-MS和过表达回补实验分析pp GalNAc-T13对底物蛋白的糖基化特异性,解析pp GalNAc-T13对神经元分化的重要性和通过底物蛋白调控神经元分化的分子机制。第二部分:用叠氮化的单糖类似物培养野生型或pp GalNAc-T13敲除的细胞,收集神经元分化后的培养上清。运用点击化学方法富集糖蛋白后进行Obitrap LC-MS/MS检测,并运用生物信息学手段分析pp GalNAc-T13参与神经元分化的具体过程和其特异的底物糖蛋白。第三部分:采用“Cre-Lox P”系统构建Galnt13的条件敲除小鼠。通过基因型鉴定和蛋白免疫印迹的方法检测小鼠Galnt13的敲除效果,跟踪记录小鼠的个数、体重等,寻找Galnt13缺失导致的生理异常。结果:第一部分:ppGalNAc-T13在体内外的神经元分化过程中均上调表达,且主要分布在神经元和神经干细胞中。敲除pp GalNAc-T13抑制了神经干细胞的聚团和神经元的分化,并降低了经典黏蛋白型O-糖蛋白PDPN（podoplanin）的表达。进一步研究发现PDPN是pp GalNAc-T13的底物蛋白,pp Gal ANc-T13介导的O-糖基化有助于PDPN蛋白稳定,而PDPN上可能存在pp GalNAc-T13特异性的糖基化位点。最后,我们发现pp GalNAc-T13促进神经元分化的作用不能被同家族的pp GalNAc-T1替代。第二部分:通过比较蛋白质组学分析,我们在神经元培养上清中共鉴定到1590个蛋白。软件预测分析发现95%的蛋白质是糖蛋白,30%以上的蛋白质（511个）是膜或分泌蛋白,其中260个蛋白质是在已有的O-GalNAc糖蛋白数据库中未见报道蛋白。生物信息学分析发现pp GalNAc-T13的潜在底物蛋白显著地与神经元分化发育、轴突生成相关,涉及到semaphorin、Notch、Wnt和integrin信号通路。第三部分:通过基因型分析和蛋白免疫印迹分析,Galnt13神经特异性和全身敲除小鼠构建成功。其中,神经特异性敲除小鼠可以正常繁殖;其后代基因型比例基本符合孟德尔遗传定律;神经特异性敲除Galnt13使得小鼠的生长缓滞,且这种现象在雌性小鼠中更为明显。结论:本研究首次报道了哺乳动物O-GalNAc糖基转移酶pp GalNAc-T13通过糖基化和稳定PDPN蛋白促进神经元分化的功能作用机制;其次,我们鉴定了与pp GalNAc-T13在神经元分化中的功能密切相关的潜在底物蛋白群;最后我们成功构建了Galnt13敲除小鼠,可用于后续pp GalNAc-T13功能研究的工具。本研究有助于深入理解O-GalNAc糖基化在神经系统中的作用,为全面解析pp GalNAc-T13的生物学功能提供了重要的研究基础和动物模型。