适度运动通过C1q/TNF--Related Protein--9改善心梗后病理性心肌重构的作用及机制研究

来源 :空军军医大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:aie520
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研究背景
  急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)在世界范围内发生率和死亡率都很高,严重威胁着人类的生命和健康.随着治疗方法的改进,AMI的短期死亡率显著降低.但心肌梗死后的病理性心肌重构可导致严重的心力衰竭甚至死亡,这已成为冠心病患者死亡的主要原因之一.美国心脏协会(American Heart Association, AHA)建议成年人进行理想的适度运动(运动持续时间≥150min/week),即每周5天,每天大于15min的运动锻炼,可以有效降低心血管疾病的发病率.临床和实验研究记录了运动对心血管疾病一级和二级预防的影响.然而,心肌梗死后患者运动强度的具体建议,以及适度运动对患者长期死亡率和病理性心肌重塑的影响仍有争议,其机制尚未完全阐明.
  机体组织细胞分泌的许多蛋白质称为分泌蛋白,在组织发育和生长、响应各种病理压力以及在细胞和组织之间的通讯中起着至关重要的作用.运动的心脏保护作用主要是通过调节心脏组织中保护性蛋白质分子的分泌来实现的,例如线粒体相关蛋白和细胞抗氧化相关蛋白.由心脏自身合成和分泌的蛋白质中包含一组称为心脏因子的蛋白质.在心肌受损时,心脏会动员心脏因子分泌,这些因子通过自分泌或者旁分泌的途径参与抑制炎症反应以及调控内环境稳态.最近发现的C1q/TNF-relatedprotein(CTRP)家族是脂联素的同源异构分子家族.其中CTRP9在心肌组织中表达量高,并且AMI后心肌CTRP9的表达显著下降,外源性补充CTRP9可以保护心脏免受缺血损伤,并减轻AMI后的病理性心肌重构.因此被认为是保护性的心脏因子成员之一.
  最新的研究发现,心梗后的运动训练可提高人血清中的CTRP9水平.但是目前心梗后怎样运动,以及适宜的运动量并没有实验数据的支持,并且运动对心肌CTRP9的分泌调节机制并不清楚,以前的研究证实了CTRP9的抗心肌重构作用,但是CTRP9在心梗后运动中发挥的作用仍未见报道.
  研究目的
  1.确定小鼠心梗后适宜的运动时间.
  2.验证心梗后运动与心肌自身CTRP9的表达分泌的关系.
  3.阐明小鼠心梗后运动调控心肌CTRP9的信号通路.
  研究方法
  (1)实验动物:①雄性C57BL/6J小鼠(6-8周龄)以及②Sprague-Dawley乳鼠(1-2天龄)由空军军医大学实验动物中心提供.③CTRP9基因敲除(CTRP9-Knockout, CTRP9-KO)小鼠由南京大学生物医学研究中心(南京)构建.④雄性CTRP9-KO小鼠(6-8周龄)及同窝野生型雄性小鼠(Wild type, WT)亦用于本研究.
  (2)基因干预:①CTRP9基因敲除小鼠的构建利用Cas9/RNAsystemgenetargeting技术;②腺相关病毒过表达心肌CTRP9:AMI模型构建过程中,结扎冠状动脉后,使用GFP标记的CTRP9腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV-CTRP9)或阴性对照病毒(Negative control adeno-associated virus, NC)心肌点注射入小鼠左心室壁.
  (3)在体实验:①小鼠AMI模型构建:消毒手术器械后,麻醉小鼠后固定至手术台.消毒后在小鼠左侧胸壁做一长约1.2cm的切口,挤出心脏后用6-0丝线结扎左冠状动脉,结扎点位于其起源处2-3mm.而后将心脏放回胸腔,并用4-0丝线打结关胸.②心梗模型构建之后检测小鼠心功能指标,应用Visualsonicvevo2100高分辨率小动物在体超声成像系统,记录动物超声数据;使用Millar导管检测小鼠血流动力学指标,超声和Millar导管的检测时间分别在心梗后第3,5,7,9和11周末.③小鼠AMI构建成功后第3周开始进行游泳训练,分为每天15min,30mim和60min游泳训练组.每次游泳训练之后将小鼠放置在恒温红外保暖箱中,待其毛发干燥之后放置在鼠笼中.④腹腔注射胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factor, IGF)-1:对于非运动组的小鼠,MI诱导后3周,通过腹膜内注射40μg/kg/day的IGF-1(溶于PBS),总共8周.对照组注射等量的PBS.⑤游泳结束之后进行血清标本和心脏标本的取材及处理,而后检测血清中的相关因子,心脏标本做石蜡切片、冰冻切片以及在-80℃低温冰箱保存.标本切片分别进行HE染色、Masson染色、白细胞分化抗原31(Cluster of differentiation31, CD31)免疫组织化学染色和麦胚凝集素(Wheat germ agglutinin, WGA)-FITC免疫荧光染色.图像用ImageJ软件分析.⑥Westernblot检测心脏CTRP9的表达,检测心肌纤维化相关分子如:转化生长因子(Transforming growth factor, TGF)β、α-平滑肌肌动蛋白(α-Smoothmuscleactin,α-SMA)、β-肌球蛋白重链(β-Myosinheavychain,β-MHC)和血管内皮生长因子A(Vascular endothelial growth factor A, VEGF-A)的表达水平.⑦使用实时定量PCR检测心肌组织中的CTRP9和纤维化相关分子的基因表达量.
  (4)离体实验:①细胞培养与处理:实验所用细胞为Sprague-Dawley大鼠的乳鼠原代心肌细胞(Neonatal rat cardiomyocytes, NCM).细胞贴壁之后更换无血清培养液,12h后加入不同浓度大鼠源性胰岛素样生长因子-1(Insulin-like growth factor 1, IGF-1)处理,12h后提取细胞蛋白.②乳鼠原代心肌细胞中加入IGF-1处理的同时,加入磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphoinositide 3-kinase,PI3K)抑制剂LY294002(NSC697286, MCE),过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)γ激动剂Rosiglitazone(ab120762, Abcam)及其抑制剂GW9662(ab141125, Abcam).12h后提取细胞蛋白.③使用Westernblot检测IGF-1相关信号通路分子PI3K、PPARγ以及CTRP9的表达情况.
  (5)统计分析:采用GraphPadPrism6软件进行统计分析,结果以平均值±标准误表示.t检验用于两组之间的比较;单因素方差分析和LSD-t检验用于多组之间的比较;多因素方差分析辅以Holm调整的事后检验用于实验组单组与多组之间的比较.P<0.05认为有统计学差异.
  研究结果
  (1)短时游泳训练显著提高心梗后小鼠的心脏功能,改善病理性心肌重构.游泳训练8周后,与MI组相比,每天15min的游泳训练(Swimming training, ST)显著减少心脏大小和心肌纤维化面积,心脏重量/体重比(HW/BW)降低.并且每天15minST逐渐增加MI后小鼠左室射血分数(Left ventricleejection fraction, LVEF),减少心脏纤维化面积,增加新生血管数目,减轻病理性心肌肥厚的程度.而与MI组相比,每天60minST并不能增加小鼠的LVEF、减少心脏纤维化面积以及增加血管新生数目,并且还加重了病理性心肌肥厚的程度.血流动力学分析表明,短时间运动训练可降低左室舒张末期压力(Left ventricleend-diastolic pressure,LVEDP),增加左室压力改变峰率(Maximum rate of pressure change in the ventricle,dp/dtmax),而每天30min和60minST增加LVEDP,降低dp/dtmax.这些结果表明,每天15minST可以提高心肌梗死后的心脏功能,改善小鼠心梗后的病理性心肌重构.
  (2)短时ST显著改变心脏因子,尤其是CTRP9的表达.我们检测了几种心脏因子在mRNA水平的表达变化情况.结果发现,MI后每天15minST增加CTRP2,CTRP7,CTRP9和FGF16的表达,并降低Fst13的表达.其中CTRP9的升高最为明显.此外,免疫印迹分析证实,短期ST显著增加CTRP9的蛋白表达.而其他运动组并没有观察到CTRP9的表达上升.因此,心脏因子CTRP9可能在每天15minST的心肌保护、抗纤维化和抗病理性心肌肥厚中起关键作用.
  (3)短时ST的心肌保护和抗病理性心肌重构的作用在CTRP9-KO小鼠上并不明显.MI+CTRP9-KO+每天15minST组的平均LVEF显著低于MI+WT+每天15minST组.与WT小鼠相比,在MI后进行相同的短时游泳运动,CTRP9-KO小鼠纤维化面积增加(P<0.05),心肌纤维横截面积减少.每天15minST不能改善MI后CTRP9-KO小鼠心肌纤维化的面积.为了进一步证明CTRP9在纤维化、病理性肥厚和血管新生相关分子的调节中是否起重要作用,我们测定了几种病理性纤维化、肥厚和血管新生相关分子.结果发现,与MI+每天15minST小鼠相比,病理性纤维化和肥厚相关分子在MI+CTRP9-KO+每天15minST组增加,而血管新生相关分子并没有明显改变.这些结果表明,短时间ST的抗纤维化和抗肥厚作用主要是由CTRP9介导调节的,而血管形成可能与CTRP9无关.
  (4)CTRP9-KO小鼠心肌过表达CTRP9,MI后适度ST可改善其纤维化和病理性心肌肥厚.小鼠MI的同时,在梗塞边界区对CTRP9-KO小鼠进行心肌内注射AAV-CTRP9,以使CTRP9心肌特异性高表达.CTRP9的过表达在第14天开始并在注射后21天达到稳定.而后进行8周的每天15minST.结果发现15min/dST+AAV-CTRP9明显改善小鼠LVEF,减少心梗边界区纤维化区域,降低心肌纤维肥厚程度.与CTRP9-KO小鼠相比,在CTRP9过表达后,TGF-β和β-MHC表达也降低.这表明CTRP9在MI后短时间ST的抗纤维化和抗肥厚作用中扮演重要角色.
  (5)在野生型和KO鼠中,短时ST均提高血清中IGF-1含量.在每天15minST持续8周后,WT小鼠和CTRP9-KO小鼠中血清中的IGF-1浓度均增加.这说明IGF-1在运动发挥的心肌保护作用中可能扮演重要角色,并且CTRP9-KO鼠的IGF-1也在此过程中升高,说明CTRP9可能是IGF-1的下游分子.
  (6)外源性补充IGF-1能够提高WT小鼠MI后的心功能,但不能提高CTRP9-KO小鼠的心功能.为了证明IGF-1的心脏保护及其在MI后病理性心肌重塑中的作用,MI3周后在小鼠腹膜内注射外源IGF-1.与MI,MI+CTRP9-KO和MI+CTRP9-KO+IGF-1小鼠相比,注射8周后的LVEF显着增加,并且HW/BW降低.WGA和CD31染色显示IGF-1的补充降低了心肌纤维的平均横截面积并增加了MI小鼠的毛细血管密度.并且与PBS注射组相比,CTRP9-KO小鼠和WT小鼠中的毛细血管密度显着增加.
  (7)细胞实验证实IGF-1通过PI3K-PPARγ信号通路激活心肌CTRP9.我们使用IGF-1、PI3K抑制剂、PPARγ激动剂和抑制剂处理大鼠原代心肌细胞.发现IGF-1能够升高心肌细胞CTRP9的表达,而加入PI3K抑制剂能够抑制IGF-1的促CTRP9表达作用.细胞用IGF-1处理后加入PPARγ抑制剂,亦能减少CTRP9的表达.同样的,使用PI3K抑制剂后,加入PPARγ激动剂,同样使CTRP9的表达比对照组上升.这些结果表明,IGF-1是通过PI3K信号通路激活PPARγ,而后调节CTRP9的表达的.
  研究结论
  (1)本研究发现心梗后的小鼠每天进行短时ST(为期8周,每天15minST)能够显著改善其心功能和病理性心肌重构,而延长ST时间(每天30min或60min)则不能改善心梗后的心功能以及病理性心肌重构,为指导临床心肌梗死病人的康复运功强度提供了实验证据.
  (2)首次发现了心梗后短时ST能够提高心脏因子CTRP9的表达,短时ST的抗纤维化和抗肥厚作用主要是通过CTRP9的表达来实现的,并且CTRP9-KO可阻断短时ST的这些抗病理重构作用.每天15minST和心脏CTRP9过表达显著增加LVEF,减少边缘区纤维化面积,增加心肌纤维厚度,为病理性心肌重构的治疗提供了新的治疗手段和治疗靶点.
  (3)本研究首次发现运动通过调节IGF-1激活心肌细胞PI3K-PPARγ信号通路从而上调CTRP9的表达,阐明了短时游泳训练改善心脏功能,减轻心梗后病理性心肌重构的分子机制.
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