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目的:1)探讨氧化铁纳米粒子(iron oxide nanoparticles,IONPs)促人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)成骨分化的作用及选择最佳IONPs成骨浓度,并通过转录组测序分析其所发挥作用的可能分子机制。2)观察氧化铁纳米粒子在大鼠牙周骨缺损修复中的应用效果。方法:1)(1)通过改良酶消化法及有限稀释法克隆化获得hPDLSCs,并应用流式技术检测第三代hPDLSCs表型。(2)体外定向三系分化培养hPDLSCs 21天后,分别探讨其成骨、成脂、成软骨分化的潜能。(3)佩尔蓝染色、透射电镜(TEM)观察IONPs在hPDLSCs的分布。(4)免疫荧光法检测IONPs处理hPDLSCs后表型;(5)CCK-8法、EdU免疫荧光检测不同浓度0μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、300μg/ml、500μg/mlIONPs处理hPDLSCs后细胞的增殖。(6)以0μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、300μg/ml、500μg/ml不同终浓度的IONPs为实验对象,采取ALP定量检测方法选取适宜的促成骨分化浓度。(7)取第三代hPDLSCs与IONPs共培养检测其向成骨方向变化的潜能,以(空白对照组:普通培养基;OS组:成骨培养基诱导;50μg/ml IONPs组:OS+IONPs组;100μg/ml IONPs组:OS+IONPs)四组为实验对象:通过应用RT-PCR分析各组成骨相关基因(COL1、ALP、RUNX2、BMP2)和Western blot检测相应蛋白的表达(COL1、ALP、RUNX2、BMP2)检测其成骨分化的能力。(8)取第三代hPDLSCs与IONPs共培养7天,RNA转录测序检测分子水平上的相关机制。随后使用Wnt信号通路抑制剂Dickkopf1(DKK1)进行预处理。将实验分为三个组:空白对照组:普通培养基、IONPs组:普通培养基+50μg/ml IONPs、DKK1抑制组:普通培养基+50μg/ml IONPs+100ng/ml DKK1。并通过检测Wnt通路相关的信号分子的mRNA和相关蛋白的表达初步探讨其所通过的机制通路。(9)以(空白对照组:普通培养基组、OS组:成骨诱导培养基组、IONPs组:普通培养基+50μg/ml IONPs组、DKK1组:普通培养基+50μg/ml IONPs+100ng/ml DKK1)四组为实验对象:检测各组成骨相关的mRNA和成骨相关蛋白表达,进一步验证IONPs是否通过Wnt信号通路来调控hPDLSCs成骨分化。2)选择SD大鼠作为实验动物,利用牙科手机慢钻在每只大鼠的下切牙远中牙槽骨处做一个3mm?2mm?1mm洞型的缺损模型;将30只SD大鼠(雌雄不限)随机分成3组:A组空白组、B组nHA组、C组nHA/IONPs组,n=10;动物建模6周后处死,对取材的新生组织行肉眼观察;并通过HE染色处理、Micro-CT检测缺损的重建情况。结果:1)(1)通过改良酶消化法获得原代hPDLSCs,4-5天在显微镜下可看到细胞从组织块中爬出,成集落生长;经过有限稀释克隆纯化后,扩增培养,细胞大小一致,生长速率快;流式技术检测细胞表型结果证实hPDLSCs高表达MSCs表型。(2)细胞多向分化能力鉴定:ARS浸染结果有多个钙化小球形成;油红O染色显示胞浆内有淡红色的脂滴;阿利新蓝染色显示为蓝色。(3)佩尔蓝染色结果:蓝染的IONPs分布于hPDLSDs的胞质中;透射电镜结果:hPDLSDs的细胞质中可以见到颗粒状的IONPs。(4)IONPs处理后的hPDLSCs仍高表达MSCs表型:免疫荧光检测结果STRO-1和Vimentin阳性表达,Keratin阴性表达。(5)CCK-8检测结果显示IONPs的终浓度在100μg/ml以内,细胞的增长速率不受影响;EdU免疫荧光法检测结果显示IONPs的浓度到达300μg/ml时,新增细胞数目呈现为明显的下降。(6)ALP定量检测结果:IONPs组ALP活性值强于control组和OS组,且IONPs浓度在50μg/ml时成骨效果最佳,且P<0.05。(7)RT-PCR和Western blot结果:与对照组相比,OS组和IONPs组的mRNA(COL1、ALP、RUNX2、BMP2)及其相应蛋白(COL1、ALP、RUNX2、BMP2)表达明显增高,且P<0.05,其中IONPs组高于OS组,且P<0.05。(8)RNA转录组测序及结果验证显示:RT-PCR和Western blot检测IONPs组高表达Wnt通路主要的相关因子LRP5、LEF1、β-catenin、cyclind的mRNA和相关蛋白的表达,且P<0.05。(9)RT-PCR和Western blot的统计分析显示IONPs组成骨相关的mRNA及相应蛋白表达量强于control组,且P<0.05。而加入DKK1抑制组成骨相关的mRNA和蛋白表达显著低于IONPs组,且P<0.05。推测氧化铁纳米粒子促进hPDLSCs向成骨方向的转化可能是受Wnt信号通路的影响。2)术后6周处死大鼠,肉眼观察:IONPs/nHA组缺损处几乎被新生组织完全覆盖,缺损边界不清晰;nHA组缺损处也有较多新生组织形成,缺损边界可见;control组缺损处还未发现新生组织形成。组织学观察,发现IONPs/nHA组有新生骨组织形成、骨再生明显优于其他组;Micro-CT结果与组织学检测结果一致。结论:1)IONPs能够促进hPDLSCs的成骨分化,且体外IONPs的终浓度为50μg/ml时是其最佳的促成骨分化浓度,另外还推测IONPs促hPDLSCs成骨分化可能受Wnt信号通路调控。2)氧化铁纳米粒子复合纳米羟基磷灰石能够促进大鼠牙周骨缺损修复。