马尾松CYP720B1基因的克隆与分析

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马尾松分布广、速生,是我国重要的采脂树种,有很高经济价值。松脂除了可被加工为工业产品带来巨大经济效益外,于树木本身的初生、次生代谢也有着重要作用。松脂的主要成分是萜类化合物,CYP720B1属于萜类合成过程中的后修饰酶,是P450酶的一种,影响着萜类物质的形成,对马尾松的生长、防御具有意义。通过PCR技术获得PmCYP720B1基因,对其进行生物信息学分析;q PCR技术检测该基因在不同组织中的表达差异;结合密码子偏好性分析结果,选择使用烟草,观测该基因编码蛋白在细胞中的表达部位;对拟南芥进行稳定转化,通过酶联免疫分析和SPME-GC-MS技术对PmCYP720B1的功能进行初步研究;使用马尾松下胚轴诱导出马尾松非胚性愈伤组织,进行瞬时转化,对过表达PmCYP720B1的转基因样品进行转录组测序及分析;使用Tail-PCR技术克隆出PmCYP720B1基因的启动子,对启动子顺式作用元件进行预测分析,使用烟草瞬时转化法对启动子表达活性进行验证。主要结果如下:(1)克隆获得了PmCYP720B1长1446bp的ORF序列,编码481个氨基酸。该蛋白为稳定的亲水蛋白。预测该蛋白没有信号肽,为非分泌蛋白。蛋白质三级结构预测结果与PDB数据中酿酒酵母CYP51(7ry8A)蛋白、拟南芥CYP90B1(6a15A)蛋白、蓝细菌CYP120A1(2ve3A)蛋白等蛋白三级结构相似度高。密码子偏好性分析表明该基因使用模式植物拟南芥或烟草进行异源转化具有一定适用性。(2)实时荧光定量分析马尾松根、茎、老叶和新叶组织中的PmCYP720B1表达量,发现PmCYP720B1在新叶组织中表达量最高,在茎中表达量最低。(3)将PmCYP720B1基因构建于带有GFP标记的载体上,使用注射法将带有GFP绿色荧光标记的重组质粒和带有m Cherry红色荧光标记定位于内质网的空载质粒对烟草进行共转化,激光共聚焦显微镜观测到PmCYP720B1蛋白在细胞中的表达位置位于内质网。(4)使PmCYP720B1基因稳定在拟南芥中表达,通过抗性筛选获得T2代转基因拟南芥,通过分子及蛋白水平检测,确认PmCYP720B1基因在拟南芥中成功表达。表型比对观察,发现转基因植株的茎节间明显比野生型的茎节间长,转基因植株的莲座叶较野生型的莲座叶更大。对转基因拟南芥中p450酶含量进行测定,发现P450酶含量有所提升。对光合色素叶绿素a、b和类胡萝卜素含量进行测定,发现含量均有所提升。对转基因拟南芥油菜素甾醇(BR)含量进行测定,发现其含量有所提升。使用SPME-GC-MS法对转基因拟南芥的叶片代谢物含量进行检测,发现在比对上的前40种物质中转基因拟南芥含有的代谢物种类更为复杂,萜类物质占比最高,其中3-(三甲基硅氧基)苯甲酸三甲基硅酯相对含量升高。(5)通过马尾松下胚轴诱导出马尾松非胚性愈伤组织,使PmCYP720B1基因过表达。将成功转化的愈伤组织进行转录组测序,对测序结果进行了主成分分析、相关性分析,发现转基因样品和对照组间可以很好的分离,且生物学重复性较好。进行了差异基因分析、COG与KOG分析、GO分类富集分析、KEGG分类富集分析,发现差异响应基因涉及碳水化合物运输与代谢、植物激素的信号转导、次生代谢物生物合成、防御等方面。(6)使用Tail-PCR法克隆得到PmCYP720B1基因启动子,启动子序列长度为2059bp。对其转录起始位点和顺式作用元件进行预测,预测PmCYP720B1启动子含有光响应元件、防御性元件、激素类响应元件等。成功将PmCYP720B1基因起始密码子上游1961bp克隆到表达载体p BI121上,在烟草中瞬时表达。通过GUS染色可知PmCYP720B1基因的启动子在烟草的根、茎、叶中均可驱动GUS表达。将转基因烟草叶片进行光、赤霉素(GA3)、生长素(IAA)处理后,可诱导GUS表达。本论文克隆得到PmCYP720B1基因及其启动子序列,进行初步的功能分析,发现PmCYP720B1可影响萜类物质与甾类物质的生成,在植物生长与代谢方面发挥作用。
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