肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是威胁人类健康的重大疾病,在我国具有发病率高、预后不良、五年生存率短等特点。目前,常规治疗肝癌的方法是手术切除和放疗、化疗。但由于肿瘤大小和生长部位以及肿瘤易复发和转移等诸多因素,许多患者难以施行切除手术,只能借助其他方法加以治疗,最常用的方法便是化疗。常用的治疗肝癌的化疗药物包括雌激素受体拮抗剂、血管生长因子受体与生长因子受体拮抗剂、DNA损伤类药物。然而,肝癌的化疗抵抗效应显著,单独使用这些化疗药物、甚至联合用药在肝癌的治疗中仍收效甚微,因此,探索并揭示肝癌中化疗抵抗的关键机制具有重要的临床意义。RNA结合蛋白(RBP)是转录后修饰的重要参与者。RBP-RNA相互作用网络在肿瘤发生发展中的重要作用已被广泛报道。RBP功能的异常可以改变多种肿瘤标志性特征进而影响肿瘤发生发展,如调节肿瘤细胞增殖和转移、改变肿瘤细胞死亡抵抗能力、影响肿瘤细胞代谢水平和基因组不稳定性、调节肿瘤细胞免疫逃逸等。RBP功能复杂且重要,即使是微小的改变也能造成重大的生理病理影响,目前,关于RBP-RNA相互作用在肿瘤发生发展中的作用和机制研究仍有许多未解问题,值得进一步探索。ZCCHC4是锌指蛋白家族成员之一,属于RBP,关于它的功能目前鲜有报道。我们实验室前期的研究结果表明ZCCHC4参与调节机体抗乙型肝炎病毒的免疫反应,因此推测ZCCHC4有可能参与肝癌发生发展。本研究旨在研究ZCCHC4在肝癌发生发展中的作用及其机制,探讨ZCCHC4能否成为辅助化疗的靶标,为肝癌临床治疗提供参考。第一部分ZCCHC4参与肝癌化疗抵抗的功能研究为了研究ZCCHC4在肝癌发生发展中的作用,我们首先利用人肝癌组织芯片,检测ZCCHC4蛋白在肝癌组织中的表达水平,发现ZCCHC4在肝癌癌组织中表达量显著高于相应的癌旁组织,且ZCCHC4高表达的患者总体生存时间显著缩短。进一步,我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了三株ZCCHC4敲除的HepG2细胞株(ZCCHC4_KO),并利用该细胞株进行裸鼠皮下荷瘤实验。发现荷ZCCHC4_KO细胞株的小鼠肿瘤生长速度显著低于荷HepG2正常细胞系的小鼠,且荷ZCCHC4_KO细胞系的小鼠生存时间显著长于荷HepG2正常细胞系的小鼠。以上结果说明ZCCHC4具有促进肝癌生长的作用。进一步,我们通过RNA测序比较野生型HepG2细胞和ZCCHC4_KO细胞的差异转录组,发现ZCCHC4敲除导致368个基因表达上调以及851个基因表达下调。GO分析结果提示上调的差异基因主要参与细胞分化发育和细胞死亡,下调的差异基因主要参与细胞分化、细胞迁移和细胞增殖。KEGG信号通路富集分析发现下调的基因主要参与PI3K-AKT信号通路、p53信号通路以及肿瘤相关信号。以上结果提示ZCCHC4对细胞生存、细胞活力可能发挥重要作用。接着,我们在肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721细胞中干扰ZCCHC4,发现干扰ZCCHC4后奥沙利铂诱导凋亡细胞的百分比显著增高,且凋亡相关信号通路Cleaved PARP和Cleaved caspase3表达水平显著上调,奥沙利铂诱导的细胞杀伤作用以及克隆生长抑制作用也更加显著。而在HepG2和SMMC-7721细胞中过表达ZCCHC4,可以显著抑制奥沙利铂诱导的凋亡。我们又利用阿霉素重复了类似实验。阿霉素的实验结果与奥沙利铂一致,干扰ZCCHC4增加了肝癌细胞对阿霉素的敏感性,过表达则相反。此外,我们利用稳定高表达ZCCHC4的HepG2细胞株进行小鼠皮下荷瘤实验,研究奥沙利铂的抗肿瘤效果,结果发现奥沙利铂能够显著抑制荷HepG2细胞系的小鼠肿瘤生长,但对荷稳定高表达ZCCHC4的HepG2细胞株的小鼠肿瘤生长没有显著影响。以上结果说明ZCCHC4在肝癌生长与化疗中发挥了凋亡抵抗的作用。为了探究ZCCHC4的凋亡抵抗效应是否具有普遍意义,我们进一步通过不同类型的肿瘤组织芯片分析ZCCHC4的表达情况。结果发现,ZCCHC4在肺癌、胰腺癌、结肠癌的癌组织中表达显著高于对应癌旁组织,且ZCCHC4高表达与肺癌、胰腺癌患者短的总体生存时间相关。在肺癌细胞系A549、胰腺癌细胞系BXPC-3、结肠癌细胞系HCT116中干扰ZCCHC4后,奥沙利铂诱导的凋亡百分比显著增加。说明ZCCHC4在肿瘤细胞中具有广泛的凋亡抵抗作用。通过第一部分研究,我们揭示了ZCCHC4是肝癌的促癌基因,参与肝癌对奥沙利铂和阿霉素的凋亡抵抗作用,且ZCCHC4的凋亡抵抗作用在肺癌、胰腺癌、结肠癌中普遍存在,提示ZCCHC4有可能作为辅助化疗的潜在靶点,其作用的分子机制如何?值得深入研究。第二部分:ZCCHC4参与肝癌化疗抵抗的表观机制研究为了进一步研究ZCCHC4参与凋亡抵抗的作用机制,我们首先分析了ZCCHC4的亚细胞定位情况,通过免疫印迹和免疫荧光实验发现ZCCHC4在肝癌细胞中主要定位于细胞核。接着,我们检测了肝癌细胞的DNA损伤相关信号,发现在HepG2细胞和SMMC-7721细胞中干扰ZCCHC4后,奥沙利铂诱导的DNA损伤相关信号pATM、pATR、pCHK1、pCHK2、gH2AX表达上调,过表达后则相反,说明ZCCHC4可以抑制奥沙利铂诱导的DNA损伤。接着,通过免疫共沉淀(Co-IP)实验,我们发现ZCCHC4与gH2AX直接结合,且结合的强度随着奥沙利铂刺激时间延长而增强。通过IP后蛋白质谱分析也证实IP下来的条带含有H2AX。此外,免疫荧光实验也发现奥沙利铂刺激24h后ZCCHC4和gH2AX存在共定位。以上结果表明,DNA损伤诱导的细胞凋亡情况下ZCCHC4和gH2AX存在相互作用。ZCCHC4包含锌指结构域,属于RBP,是否有可能ZCCHC4结合RNA并由所结合的RNA参与了ZCCHC4发挥上述生物学功能?我们通过PAR-CLIP-seq寻找与ZCCHC4相结合的基因间长链非编码RNA(lincRNA)。通过对测序得到的107个lincRNA进行筛选,最终发现了拮抗ZCCHC4凋亡抵抗作用的lincRNA—AL133467.2。AL133467.2在胞浆胞核中均有定位,目前尚未有关于AL133467.2的报道。在干扰ZCCHC4的基础上干扰AL133467.2降低了肝癌细胞对奥沙利铂的敏感性,抑制gH2AX上调,单独干扰AL133467.2对奥沙利铂敏感性和gH2AX变化的作用不明显。通过RIP实验、RNA pulldown实验、FISH实验,证实胞核中存在ZCCHC4/AL133467.2/gH2AX复合物。通过第二部分研究,我们发现了新的核内复合物ZCCHC4/AL133467.2/gH2AX复合物,该复合物能通过调节化疗药物的DNA损伤反应进而影响化疗效果,更具体的分子机制尚待更深入的研究。综上所述,通过本课题的研究,我们发现了RNA结合蛋白ZCCHC4可以促进肝癌生长,参与肝癌对DNA损伤类化疗药物的凋亡抵抗,且ZCCHC4的凋亡抵抗作用在肺癌、胰腺癌、结肠癌中普遍存在。ZCCHC4发挥凋亡抵抗作用是通过抑制DNA损伤实现的,且与ZCCHC4/AL133467.2/gH2AX复合物的功能密不可分。该研究结果不仅发现了新的与DNA损伤相关的核内复合体,丰富了我们对核内复合物网络与功能的认知,还揭示了在化疗抵抗中发挥重要功能的RNA结合蛋白及其新机制,为肿瘤治疗提供了新的潜在靶点。