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中东呼吸综合征（Middle East respiratory syndrome,MERS）是由中东呼吸综合征冠状病毒（MERS coronavirus,MERS-Co V）引起的一种人兽共患传染病,具有传染性强,死亡率高等特点。人和骆驼为易感动物。目前,人感染MERS-Co V病例持续发生,单峰骆驼是MERS-Co V的主要宿主和人感染MERS-Co V的主要来源。已有研究表明,当地单峰骆驼MERS-Co V体液免疫水平与本地MERS-Co V流行情况呈负相关。WHO发布的《MERS-Co V疫苗目标产品简介》中已指出,免疫单峰骆驼可能是阻断人类MERS疫情暴发的最佳方式,并且可能是更快的疫苗研发和获批方式。因此,研究安全、有效的MERS-Co V单峰骆驼用疫苗,防止单峰驼群中MERS-Co V流行,从源头阻断MERS-Co V传播,对防控人感染MERS-Co V意义重大。目前,尚无获批针对MERS-Co V的疫苗。实验室前期已成功研制出MERS-Co V重组狂犬病病毒(r SRV9-MERSS1),但经灭活后免疫效力不理想。佐剂作为疫苗中一种可非特异性增强或改变机体对抗原免疫应答的物质。为提高灭活r SRV9-MERSS1免疫原性,本文筛选并开展了针对灭活r SRV9-MERSS1的复合佐剂研究。黏膜免疫对于防控MERS具有重要作用,为预防单峰骆驼MERS-Co V感染或减少MERS-COV在单峰骆驼黏膜上释放。本研究利用蛋白抗原新型展示系统制备具有黏膜免疫增强作用的MERS-Co V细菌样颗粒疫苗,并对其免疫原性进行研究。具体研究内容如下:1.灭活rSRV9-MERSS1免疫复合佐剂的筛选本研究首先选择不同类型佐剂（ISA201VG、IMS1313VG、GEL01、Alum和Poly I:C）分别与灭活r SRV9-MERSS1混合,制备灭活病毒疫苗,免疫小鼠,检测MERS-Co V中和抗体效价、特异性Ig G及其亚型等参数,评价各佐剂对灭活r SRV9-MERSS1中MERS-Co V相关免疫效果的影响。在此基础上,探索将效果明显的ISA201VG和Poly I:C两种佐剂联合应用,制备ISA201VG＆Poly I:C复合佐剂,与灭活r SRV9-MERSS1混合,制备灭活病毒复合佐剂疫苗,免疫小鼠,检测MERS-Co V中和抗体效价、特异性Ig G及其亚型等参数;免疫羊驼,检测MERS-Co V中和抗体效价及持续时间,评价复合佐剂对灭活r SRV9-MERSS1的免疫增强效果。研究结果表明,ISA201VG对灭活r SRV9-MERSS1中MERS-Co V相关免疫增强效果优于其余4种佐剂,中和MERS-Co V假病毒的抗体效价可达1:409,Poly I:C加入ISA201VG后,可显著增强对灭活r SRV9-MERSS1中MERS-Co V相关免疫效果,中和MERS-Co V假病毒的抗体效价可提升至1:1 434,且在羊驼上2免后第3周中和抗体效价可达1:2 730,抗体持续期达10个月。2.灭活rSRV9-MERSS1复合佐剂疫苗免疫效果评价首先对灭活rSRV9-MERSS1复合佐剂疫苗中抗原和Poly I:C剂量进行优化,免疫小鼠,以MERS-Co V中和抗体效价为指标,优化免疫剂量。在此基础上,比较复合佐剂相对单佐剂对灭活r SRV9-MERSS1在机体内免疫反应的影响。通过MERS-Co V攻毒保护试验和RABV攻毒保护试验,验证灭活r SRV9-MERSS1复合佐剂疫苗的免疫效果。研究结果表明,在小鼠上,灭活r SRV9-MERSS1剂量为10μg/只和Poly I:C剂量为10μg/只为最佳免疫剂量,Poly I:C加入ISA201VG乳剂后能显著提高引流淋巴结中免疫细胞的活化、脾淋巴细胞增殖、脾脏中CD4+T细胞和CD8+T细胞比例、免疫记忆细胞水平和细胞因子分泌等;免疫过复合佐剂疫苗组的小鼠,经FRNT检测中和效价可达1:436,在感染MERS-Co V后第3天能完全清除肺内病毒,同时,Poly I:C加入ISA201VG乳剂后能显著提高RABV中和抗体水平,且能100%保护小鼠免受RABV感染。3.MERS-CoV细菌样颗粒的构建与鉴定为构建MERS-CoV细菌样颗粒,首先,制备GEM颗粒并经电镜观察,其次利用昆虫细胞/杆状病毒表达系统,分别构建并鉴定三种重组杆状病毒:r BV-RBD-linker-PA2,r BV-RBD-linker-PA3和r BV-RBD-PA3,分别表达融合蛋白RBD-linker-PA2、RBD-linker-PA3和RBD-PA3,经分别与GEM颗粒结合后,进行IFA、SDS-PAGE和WB鉴定,并比较结合活性。研究结果表明,制备的GEM颗粒保持原菌形状大小,表面光滑,各融合蛋白均能分泌表达,且均能与GEM颗粒结合,其结合量依次为:RBD-linker-PA3＞RBD-PA3＞RBD-linker-PA2。因此,选择RBD-linker-PA3-GEM和RBD-PA3-GEM作为免疫原对其免疫原性进行研究。本研究为进一步完善GEM-PA展示系统奠定前期基础。4.MERS-CoV细菌样颗粒疫苗实验免疫研究首先将RBD-linker-PA3-GEM颗粒和RBD-PA3-GEM颗粒分别与复合佐剂混合,经肌肉注射途径免疫小鼠,检测MERS-Co V中和抗体效价,比较它们之间的免疫原性。其次,以免疫原性较好的RBD-linker-PA3-GEM颗粒与GEL01佐剂混合,滴鼻免疫小鼠,检测MERS-Co V中和抗体效价、血清特异性Ig G抗体及其亚型、肺灌洗液和肠洗液中特异性Ig A抗体等。研究结果表明,相比RBD-PA3-GEM,RBD-linker-PA3-GEM能诱导更高的MERS-Co V中和抗体水平,RBD-linker-PA3-GEM滴鼻免疫小鼠,能诱导产生局部黏膜免疫反应和系统性的细胞免疫和体液免疫反应。5.两种MERS-CoV候选疫苗免疫效果比较上述研究的两种MERS-CoV候选疫苗,一个以病毒为载体嵌合表达MERS-Co V抗原蛋白制备的灭活r SRV9-MERSS1,另一个是以GEM颗粒为载体表面展示MERS-Co V抗原蛋白制备的MERS-Co V细菌样颗粒。为比较不同载体MERS-Co V候选疫苗免疫效果,首先对两种不同抗原进行粒径分析,其次,以灭活r SRV9-MERSS18μg/只,MERS-Co V细菌样颗粒分别为1μg/只、5μg/只和20μg/只,分别与复合佐剂混合,肌肉注射免疫小鼠,检测MERS-Co V中和抗体效价、特异性Ig G抗体及其亚型等,比较其体液免疫和细胞免疫水平。研究结果表明,r SRV9-MERSS1颗粒的大小在167 nm左右,而RLP3-GEM颗粒大小在2 161 nm左右;灭活r SRV9-MERSS1疫苗产生抗体速度快,且细胞免疫较好;而MERS-Co V细菌样颗粒疫苗产生的体液免疫效果好,即使最低剂量1μg/只组,其抗体水平也显著高于灭活r SRV9-MERSS1疫苗组。综上所述,本研究成功设计并筛选出针对灭活r SRV9-MERSS1的一种复合佐剂;制备的MERS-Co V细菌样颗粒疫苗具有良好的免疫效果,为MERS兽用新型疫苗研发奠定基础。