胰腺癌是一种恶性程度极高的肿瘤，近年来其患病率在全球范围内呈上升趋势，在美国每年新发现病例约28000人，居恶性肿瘤死亡原因的第4位，胃肠道肿瘤死亡原因的第二位。我国上海地区统计结果表明，1963年上海市胰腺癌的发病率为1.25/10万，1977年上升至4/10万，到1995年激增为9.4/10万，居全身恶性肿瘤的第7或第8位，已成为我国常见的恶性肿瘤。胰腺癌位置隐秘，临床症状不典型，一旦发现多属晚期。虽然胰腺癌影像学诊断技术取得了较大的进步，但胰腺癌总的预后并无显著改观，术后5年生存率仍在5%左右。近年来，通过对胰腺癌相关的分子生物学研究表明，胰腺癌的发生、发展与K-ras、DPC4、p16、p53等基因及端粒酶活性有密切关系，尤其是K-ras基因，在胰腺癌中有极高的突变率（75%～100%），突变位点固定在第一外显子第12密码子，且在胰腺癌早期甚至是癌前病灶中已存在K-ras基因突变。因此很多学者开始在临床标本如血液、胰液、十二指肠液、粪便、胰腺细针穿刺活检标本中检测K-ras基因突变，希望能够早期诊断胰腺癌。p53基因是一种肿瘤抑制基因，58%(100%（平均78%）的胰腺癌细胞系和70%(86%的原发性胰腺癌中存在p53基因突变，而慢性胰腺炎等良性病变中尚未发现p53基因突变，其在胰腺癌诊断方面的应用受到重视。此外关于胰腺癌p16基因的研究多集中于确失和突变，尚未见关于胰腺原发瘤中p16基因甲基化改变及其临床病理意义的研究报道。因此本研究采用ERCP下胰管细胞刷获取胰腺癌及慢性胰腺炎细胞学标本以及放置鼻胰管收集胰液和手术切除的新鲜胰腺癌组织标本为研究对象，通过检测K-ras基因突变、p53基因突变、p16基因甲基化及其基因表达，探讨内镜下胰液及胰管刷检细胞中K-ras基因突变、p53基因突变、p16基因甲基化的检测及其联合应用对胰腺癌早期诊断及鉴别诊断的价值以及p16基因甲基化在胰腺癌发生、发展中可能的作用，筛选出最适合临床应用的胰腺癌早期诊断的方法。一、 胰腺癌胰管刷检标本中K-ras基因突变及p53基因突变的检测目的：探讨胰管刷检标本中K-ras基因突变及p53基因突变对胰腺癌的诊断及鉴别诊断价值。材料和方法：本研究采用ERCP下胰管细胞刷检方法收集了44例胰腺<WP=5>疾病患者细胞学标本及相应部分胰腺癌组织学标本，对细胞标本进行了常规细胞学检查，同时采用聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR-SSCP）分析和直接测序法检测了胰管刷检细胞和胰腺癌组织的K-ras基因第12密码子点突变，采用免疫组化的方法检测了胰管刷检细胞p53蛋白的表达，评价各标志物单独及联合应用对胰腺癌诊断及鉴别诊断价值。结果：44例胰腺疾病患者均成功收集到细胞标本，无操作相关的严重并发症发生。胰腺癌常规细胞学检查的阳性率为48％，胰腺良性疾病细胞学检查均为阴性。单纯细胞学检查诊断胰腺癌的敏感性为48％、特异性为100％、诊断准确性70.4%、阳性预测值100％、阴性预测值59％。44例胰管刷检细胞学标本均成功进行PCR扩增，25例胰腺癌刷检细胞中K-ras基因的突变率为72％（18/25），14例慢性胰腺炎中K-ras基因的突变率为14％（2/14），胰腺囊腺瘤未见K-ras基因突变。对2例K-ras基因突变的慢性胰腺炎患者分别随访18个月和12个月，病情无恶化。胰管细胞刷检标本K-ras基因突变检测诊断胰腺癌的敏感性为72％、特异性为89％、诊断准确性79.5%、阳性预测值71％、阴性预测值70.8％。测序表明胰管刷检细胞中K-ras基因突变类型与相应组织标本一致。29例胰管刷检细胞学标本检测了p53蛋白表达情况，其中胰腺癌p53蛋白阳性率为59％（10/17），胰腺良性疾病p53蛋白均为阴性，胰管细胞刷检标本p53蛋白检测诊断胰腺癌的敏感性为59％、特异性为100％、诊断准确性76%、阳性预测值100％、阴性预测值63％。29例胰管刷检细胞学标本同时检测了K-ras基因突变及p53蛋白表达，二者联合检测诊断胰腺癌的敏感性为88.2％、特异性为91.7％、诊断准确性89.7%、阳性预测值93.8％、阴性预测值84.6％。结论：ERCP下胰管细胞学刷检操作简单、实用、并发症少，刷检所得细胞形态完整，诊断特异性高，但敏感性较低。刷检所得细胞数多，可用于分子生物学及免疫组织化学检测。联合检测胰管刷检细胞K-ras基因突变及p53蛋白表达可提高胰腺癌的诊断率及诊断准确性，可以作为一种胰腺癌诊断的有效辅助手段。二、 胰腺癌组织和胰液中p16基因启动子区5’CpG岛甲基化及其表达研究目的：探讨胰腺癌 p16基因启动子区5’CpG岛甲基化改变的特点和其临床意义，以及胰液中p16基因甲基化检测对胰腺癌早期诊断的价值。材料与方法：本研究采用ERCP下鼻胰管引流术收集的22例胰腺疾病患者胰液标本以及36例胰腺癌组织标本、5例癌旁正常胰腺组织、1例正<WP=6>常胰腺组织、7例慢性胰腺炎组织为研究对象，采用MSP法检测胰腺癌组织、非癌组织和胰液中p16基因启动子区5’CpG岛甲基化改变情况，采用免疫组织化学方法检测胰腺癌组织和非癌组织中p16蛋白表达情况，采用RT-PCR方法检测胰腺癌组织和非癌组织中p16mRNA表达情况，评价其在胰腺癌发生发展中的可能作用以及其在胰腺癌诊断方面的应用价值。结果：36例胰腺癌组织中14例p16基?