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[研究背景]随着社会步入老龄化,骨关节炎的发病率高,严重影响社会劳动力。目前没有特效药物治疗,人工关节存在多种并发症,是风湿科和骨科的难题。组织工程学修复是潜在的治愈骨关节炎的方法之一。目前软骨细胞移植的细胞来源,包括自体软骨细胞培养和间充质干细胞体外诱导分化为软骨细胞培养。骨髓来源的间充质干细胞便于取材,有自我更新能力,与自体软骨细胞相比,更具有应用前景。目前间充质干细胞诱导分化为软骨细胞的机制尚不清楚,且诱导分化的细胞多为软骨样细胞,软骨细胞表型的稳定性维持不理想。microRNA是一类具有调控作用的小分子,在肿瘤的发生发展过程的作用已得到了认可。研究表明[1-5]microRNA在骨和软骨细胞分化过程中起调节作用。但是,microRNA靶基因得到明确的数据少,对于microRNA在软骨分化中的调控机制研究不足。该研究主要解决的科学问题：1)如何建立稳定的间充质干细胞体外诱导分化为软骨细胞的方法?2)探讨microRNA在诱导分化过程中的调控作用机制?最终目的是优化间充质干细胞向软骨细胞分化的条件,为软骨移植提供稳定可靠细胞来源,最终解决骨关节炎的治疗问题。[目的]1、建立人骨髓间充质干细胞诱导分化为软骨细胞的稳定方法,为科研实验提供稳定的细胞来源。2、检测人骨髓间充质干细胞诱导分化为软骨细胞过程中microRNA的表达谱及其变化,并验证以上变化。3、寻找在人骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞过程中可能起作用的microRNA,并探索其作用机制。[方法]1、将体外培养的人骨髓间充质干细胞分为2组：未诱导分化组(DSCM原代培养基)、诱导分化组(MCDM诱导分化培养基三维诱导培养)。分别培养21天,倒置相差显微镜观察细胞形态,免疫荧光染色、免疫组化染色、Western Blot法检测Ⅱ型胶原的表达,阿利新蓝染色检测蛋白多糖的表达。2、将人骨髓间充质干细胞体外三维诱导培养,分别提取诱导培养第0天(stemC)、第7天(boneC)细胞总RNA,进行小RNA表达谱高通量检测,分析诱导分化过程中microRNA中类、数量的变化。将体外培养的人骨髓间充质干细胞分为两组：未诱导分化组、诱导分化组,分别提取2组培养d0、d7、d14天细胞RNA,并通过实时荧光定量PCR方法验证microRNA的变化。3、RUNX3是在软骨细胞分化过程中起关键作用的蛋白,通过生物信息学软件预测靶基因可能为RUNX3的microRNA种类,并选取在高通量检测中变化明显的microRNA,进行双荧光素酶报告基因验证microRNA与靶基因mRNA3’非翻译区的相互作用。利用重组腺病毒感染细胞过表达或者抑制表达相应microRNA,并以对照病毒感染细胞作为对照组,感染48小时后Western Blot法检测对RUNX3蛋白表达的影响,进一步明确microRNA的作用机制及对细胞功能的影响。[结果]1、未诱导分化组与诱导分化组相比：两组细胞均贴壁良好,诱导分化组细胞逐渐由长梭形变为多脚形态；诱导分化组Ⅱ型胶原免疫荧光染色、免疫组化染色阳性,Western Blot检测Ⅱ型胶原a1蛋白表达阳性,且诱导分化14天内表达量逐渐增多;诱导分化组细胞阿利新蓝染色阳性。2、在人骨髓间充质干细胞诱导分化为软骨细胞过程中,对boneC及stemC样品中microRNA种类及数量进行统计分析,其中boneC较stemC中上调且ratio>2、p值<0.05的microRNA有28个,boneC较stemC中下调且ratio<1/2、p值<0.05的microRNA有43个(ratio:boneC样品标准化的microRNA表达量与stemC样品标准化的microRNA表达量的比值)。分别提取未诱导分化组、诱导分化组d0、d7、d14天RNA,进行实时荧光定量PCR检测,两组间hsa-mir130a差异无统计学意义(p>0.05)、hsa-mir-210差异存在统计学意义(p<0.05)。3、应用TargetScan等生物信息学软件进行microRNA-靶基因预测,根据软件评分及基因功能选择了hsa-mir-19a、19b、27a、27b、210、214、330、495与候选靶基因行双荧光素酶报告基因检测,验证了hsa-mir-210与RUNX3mRNA3’UTR的相互作用。重组腺病毒感染细胞48小时后,Western Blot检测hsa-mir-210过表达组、对照组、hsa-mir-210表达抑制组RNUX3蛋白表达量：表达抑制组>对照组>过表达组。[结论]1、人骨髓间充质干细胞通过特定的诱导分化培养,形态上具有软骨细胞形态,能够产生Ⅱ型胶原和蛋白多糖这两种关节软骨成分,具有软骨细胞功能,此诱导培养方法可以为后期实验提供稳定的细胞来源。2、在人骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导分化中,第7天与第0天相比,28种microRNA表达量上调至2倍以上,43种microRNA表达量下调至50%以下。通过实时荧光定量PCR证实hsa-mir-210在诱导分化过程中的表达下降,hsa-mir-130a无明显变化,与高通量测序中结果一致。3、hsa-mir-210与靶基因RNUX3mRNA3’UTR区通过预测的结合位点相互作用,阻止翻译过程,减少RUNX3的表达。在细胞中过表达hsa-mir-210可以减少RUNX3蛋白的产生,抑制表达hsa-mir-210可以增力RUNX3蛋白的产生。