柑橘是世界第一大水果,拥有庞大的栽培面积和丰富的品种资源。珠心胚是柑橘重要的生殖性状,由珠心组织侵入胚囊发育而来,它阻碍了柑橘的系统性杂交选育,但在砧木利用、品种复壮等方面具有十分积极的意义,对遗传进化和柑橘分类学研究也具有重要影响。若将此无融合生殖性状导入水稻、玉米等作物当中,将极大地简化育种程序,给农业生产带来巨大变革。柑橘珠心胚的遗传调控已有众多研究报道,但都没能落到真实的调控序列上,直到候选基因CitRWP的报道,但相关研究仍缺乏充足的证据,未能完全证实CitRWP对柑橘珠心胚的调控。本研究利用本实验室收集的芽变单胚甜橙、枳及其杂交分离后代以及其它单多胚材料,从基因组分子标记,基因表达检测,cDNA克隆测序三个层面对CitRWP基因进行分析,此外,还利用塔罗科血橙的CitRWP基因表达序列构建了超表达载体,对烟草进行转化,以综合探讨CitRWP的基因功能。1、基因组M/P分子标记验证M/P分子标记是Shimada等根据CitRWP基因启动子区的MITE转座子状况而开发的珠心胚鉴定标记,在其分析的众多柑橘材料中,标记与珠心胚具有很好的一致性,用该标记检测我们的研究材料后,发现该标记与胚性分离结果并不完全一致。在甜橙中,无论是单胚甜橙还是多胚甜橙,都存在0.75kb的单胚等位基因(M)和1.0kb的多胚等位基因(P),说明该标记并不能区分单多胚甜橙;在遗传背景相似的W-默科特×飞龙枳的杂交后代当中,M/P分子标记检测与胚性调查结果较为一致,但在多胚枳属中,没有检测到多胚等位基因(P),推测枳属的Cit RWP基因上游可能不含MITE转座子插入或其基因相应区域发生了巨大变异。2、CitRWP在不同组织器官中的表达检测胚珠是珠心胚的发生部位,因此以胚珠为检测材料对不同胚性的品种进行基因表达分析。RT-PCR检测发现,该基因在所有检测品种间都有表达条带,包括单胚甜橙和单胚柚子。2018年的实时表达检测结果显示,单多胚甜橙间CitRWP的表达量存在差异,但差异并不显著;2019年的实时表达检测结果表明,单多胚甜橙间CitRWP表达差异同样并不显著,此外,单胚甜橙表达量远远高于多胚飞龙枳。以上结果表明CitRWP在胚珠中的表达并非与品种胚性呈直接正相关。对枳及W-默科特×飞龙枳杂交后代群体子房进行CitRWP表达检测,发现三个多胚枳的表达量非常低。在F1杂交后代中,CitRWP的表达量呈极端的两极分化状态,有高表达株系5株,低表达株系10株,与已有的胚性调查记录较为一致,显示在W默科特×飞龙枳杂交群体中,CitRWP基因表达量与胚性具有一定相关性。对单多胚甜橙的嫩茎、嫩叶、老叶、子房、胚珠等不同组织部位进行表达量检测,发现不同组织部位的表达量因胚性不同而存在差异。在多胚甜橙中,嫩叶表达量最高,胚珠的表达量略低于嫩叶,嫩茎、老叶、子房等组织部位的表达量相近且远低于胚珠。单胚甜橙表达量最高的部位为胚珠,嫩叶的表达量较低且与嫩茎、老叶、子房等组织部位相近。在多胚甜橙中,嫩叶作为营养组织但却拥有最高的表达量,说明CitRWP并非在生殖组织中特异表达。3、CitRWP的cDNA克隆测序分子标记检测和定量分析一般都只选取基因中符合引物设计要求的部分进行检测,而基因功能的完成需要完整的基因表达序列,因此我们对枳属、单多胚甜橙以及单胚柚的CitRWP进行cDNA全长克隆测序。分析发现,枳属的CitRWP基因与甜橙相比存在非常大的变异,变异主要分为3种。首先是406bp位置(相对于起始密码子,后同)的106bp大片段缺失,其二是774bp位置的5bp(-TGCAG-)插入突变,其三是测序样本的起始密码子或终止密码子突变。前两种突变导致CDS序列长度不符合三联密码子正常翻译的要求,使其不能翻译出功能蛋白,第三种关键密码子的改变导致功能蛋白的错误翻译。在送样测序的所有枳属克隆中,正常翻译率仅为22.2%。在单多胚甜橙和单胚柚的CitRWP克隆测序中,存在与枳属相同的106bp片段缺失和5bp(-TGCAG-)插入突变。多胚塔罗科血橙的正常翻译率为80%,单胚甜单的正常翻译率为62.5%。单胚龙安柚、晚白柚的Cit RWP正常翻译率分别为100%和80%。多胚枳的Cit RWP基因大部分不能正常表达;多胚甜橙同样存在不能正常表达的克隆序列,单胚甜橙中正常表达与不正常表达的情况兼而有之,但正常表达概率更高;单胚的龙安柚、晚白柚中同样拥有正常的CitRWP基因表达,但并不表现出多胚性状。以上证据从完整表达序列的层面表明,CitRWP并不是控制柑橘及其近缘属珠心胚的主效或者唯一主效基因。4、CitRWP的烟草超表达在非柑橘遗传背景下开展基因的超表达研究,可为探讨CitRWP是否需要其它柑橘基因协同完成珠心胚调控提供依据,也是柑橘的无融合生殖基因用于其它作物杂种优势固定的重要步骤。本研究构建了Cit RWP超表达载体,转化烟草(Nicotiana tabacum L.cv.“W38”),获得10株转基因植株,但与野生型烟草相比,转基因烟草生长状态无明显改变,由于生长周期原因,目前尚未得到转基因烟草种子。