延边黄牛lncRNA MEG3多态性及对前体脂肪细胞分化的影响

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本试验旨在探究长链非编码RNA MEG3(maternally expressed gene 3,MEG3)单核苷酸多态性与延边黄牛生长性状之间的相关性、MEG3和miR-24-3p对延边黄牛前体脂肪细胞成脂分化、增殖和凋亡的影响及其之间的互作关系。通过DNA直接测序法和高分辨率熔解曲线技术分析了90头24月龄延边黄牛MEG3基因多态性,并结合胸宽、髋宽和腹围等12项生长性状进行关联分析;干扰和过表达延边黄牛前体脂肪细胞MEG3和miR-24-3p后,首先利用实时荧光定量PCR、油红O染色、甘油三酯含量测定、CCK-8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)和流式细胞术等方法在分子和细胞水平检测了二者对延边黄牛前体脂肪细胞成脂分化、增殖和凋亡的影响,最后利用双荧光素酶报告基因试验确定了MEG3和miR-24-3p的靶向关系,均重复三次。结果显示:1.MEG3第5外显子包含g.65745819 G>A和g.65745850 C>A两处突变,均存在两个等位基因,等位基因G、A和C、A频率分别为0.661、0.339和0.778、0.222,基因型GG、GA、AA和CC、CA、AA频率分别为0.422、0.478、0.100和0.611、0.333、0.056,卡方适应性检验显示两位点均未偏离哈迪-温伯格平衡(P>0.05)。两位点遗传纯合度、杂合度、有效等位基因数和多态信息含量分别为0.552、0.448、1.812、0.348和0.286、0.346、1.528、0.286,均处于中度多态(0.25<PIC<0.5),g.65745819 G>A位点,GA基因型胸宽性状显著高于AA基因型(P<0.05),AA基因型髋宽性状显著高于GG和GA基因型(P<0.05);g.65745850 C>A位点,AA基因型腹围性状显著高于CA基因型(P<0.05),其余基因型之间差异均不显著。2.和转染无意义的siRNA组(si-NC组)相比,转染具有干扰效率的siRNA组(si-48组)成脂分化标志基因脂肪酸合酶(Fatty acid synthase,FASN)和脂蛋白脂肪酶(Lipoprtein lipase,LPL)基因表达量显著增加(P<0.05),CCAAT增强结合蛋白(CCAAT enhancer binding proteinα,C/EBPα)极显著增加(P<0.01),增殖相关基因细胞周期蛋白D1(Cyclin-dependent kinase 1,Cyclin D1)显著增加(P<0.05),增殖细胞核抗原基因(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)极显著增加(P<0.01),促凋亡基因凋亡相关因子B(BCL2-associated X,BAX)显著降低(P<0.05),对其他基因影响不显著,细胞活力极显著增加(P<0.01),对脂质含量、甘油三酯含量和细胞凋亡率影响不显著;和over-NC组相比,over-MEG3组过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)、C/EBPα、LPL、PCNA和B细胞淋巴瘤基因2(B-cell lymphoma-2,BCL2)显著降低(P<0.05),FASN极显著降低(P<0.01),BAX显著增加(P<0.05),对其它基因影响不显著,脂质含量和甘油三酯含量显著降低(P<0.05),细胞活力极显著降低(P<0.01),细胞凋亡率显著增加(P<0.05),对其他指标影响不显著。3.和mimics NC组相比,miR-24-3p mimics组Cyclin D1、BCL2显著增加(P<0.01),PCNA极显著增加(P<0.01),MEG3显著降低(P<0.05),对其它基因影响不显著,细胞活力极显著增加(P<0.01),对其他指标影响不显著;和inhibitor NC组相比,miR-24-3p inhibitor组Cyclin D1和BCL2显著降低(P<0.05),PCNA极显著降低(P<0.01),MEG3显著提高(P<0.05),其它基因影响不显著,细胞活力极显著降低(P<0.01),细胞凋亡率显著提高(P<0.05),对其他指标影响不显著。4.mimics NC+MEG3-wt组Rluc/fluc极显著高于bta-miR-24-3p+MEG3-wt组(P<0.001),而mimics NC+MEG3-mut组和bta-miR-24-3p+MEG3-mut组差异不显著(P>0.05)。综上所述,lncRNA MEG3 g.65745819 G>A位点和g.65745850 C>A位点多态性分别与延边黄牛胸宽、髋宽和腹围性状相关,可作为延边黄牛分子标记辅助育种的候选基因;lncRNA MEG3能影响延边黄牛前体脂肪细胞细胞成脂、增殖和凋亡;miR-24-3p能影响延边黄牛前体脂肪细胞细胞增殖和凋亡;miR-24-3p和lncRNA MEG3存在靶向结合作用,为解析牛脂肪细胞成脂分化、增殖和凋亡提供了参考资料。
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