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研究背景:类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种自身免疫性疾病,以关节肿胀、疼痛、僵硬和骨骼的逐渐破坏为特征。RA的发病机制涉及多种免疫细胞、细胞因子和信号通路,导致异常的免疫反应和组织损伤。其中,CD4+T细胞在启动和维持RA方面起着关键作用。环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类由前体m RNA的反向剪接产生的内源性非编码RNA。它们在转录、转录后和翻译水平上具有多种调控基因表达的功能。近年来,越来越多的证据表明circRNA在RA中发挥重要作用,影响CD4+T细胞的分化、活化和功能。N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m~6A)修饰是真核生物中最丰富和最保守的内部转录修饰之一,在mRNA和ncRNA中都存在。m~6A修饰可以影响RNA的稳定性、剪接、迁移、结合蛋白质亲和力等,并参与各种生理过程和疾病进展的调控。值得注意的是,近期研究发现m~6A修饰可通过影响circRNA水平参与circRNA生物学功能的调控,从而在机体免疫应答中发挥作用。然而,目前对于在RA患者CD4+T细胞中m~6A修饰circRNA的分布特征及其对CD4+T功能的影响还不清楚。研究目的:本课题旨在探讨m~6A修饰的circRNAs在CD4+T细胞中的表达差异谱,及m~6A修饰hsa_circ_0000817通过调节CD4+T细胞功能在RA发生发展中的影响,为揭示RA的分子机制及寻找新型治疗靶点提供新思路。研究方法:1.分别选择12例RA患者和12例健康对照者(healthy control,HC),采用m~6A-Circular RNA Epitranscriptomic Microarray(8*15K)芯片技术检测RA和HC外周血CD4+T细胞中m~6A-circRNA的表达情况。2.根据芯片技术检测结果,筛选了3条可能与RA发生发展相关m~6A-circRNA(hsa_circ_0001931、hsa_circ_0001313、hsa_circ_0000817)。然后本研究将备选的m~6A-circRNA采用MeRIP-qPCR进行验证。3.RT-qPCR检测上述3条circRNA和m~6A修饰酶相关基因在HC和RA患者CD4+T细胞中的表达情况:细胞总RNA提取按照Trizol试剂盒说明书进行操作,分光光度法测定总RNA浓度。根据逆转录试剂盒说明书将细胞总RNA逆转录合成cDNA。应用SYBR试剂盒在ABI 7500实时荧光定量PCR仪上测定目的基因相对表达水平,探讨hsa_circ_0000817和m~6A修饰酶相关基因在RA CD4+T细胞中的差异性表达及二者的相关性。4.流式细胞检测HC和RA患者外周血中Th17细胞比例(TH17%):提取CD4+T细胞重悬,加入细胞激活剂后放入恒温箱培养5h,之后用表面抗体抗人CD3-APC-Cy7和抗人CD4-BB700对细胞进行表面标记,并固定透化。用内源性抗体抗人IL-17A-PE对细胞进行内源性标记,并洗涤去除多余的抗体,用流式细胞仪对标记的细胞进行检测和分析。探讨HC和RA患者外周血中的Th17%是否有差异及hsa_circ_0000817和Th17%的相关性。5.分析hsa_circ_0000817表达与RA疾病严重程度及治疗的关系:根据hsa_circ_0000817的RT-qPCR检测结果,分析RA患者外周血CD4+T中hsa_circ_0000817表达水平与性别、年龄、RA患者疾病活动度、临床表现、自身抗体水平(anti-CCP、RF等)及炎症程度(ESR、CRP、Ig G、C3、C4等)、治疗预后的关系。研究结果:1.m~6A-Circular RNA Epitranscriptomic Microarray(8*15K)芯片检测结果显示与HC组相比,RA组有71个circRNA的m~6A修饰百分比存在差异表达(5个上调,66个下调),204个circRNA的m~6A修饰存在差异表达(195个上调,9个下调)。2.Me RIP-qPCR验证芯片结果:根据芯片检测结果,本研究筛选了3条可能与RA发生发展相关m~6A-circRNA(hsa_circ_0001931、hsa_circ_0001313、hsa_circ_0000817)。收集12例RA和12例HC外周血CD4+T细胞标本进行的Me RIP-qPCR检测结果显示,hsa_circRNA_001931的m~6A修饰水平在RA患者外周血CD4+T细胞中显著上调,hsa_circ_0001313的m~6A修饰水平在RA患者外周血CD4+T细胞中无表达改变,而hsa_circ_0000817的m~6A修饰水平在RA患者外周血CD4+T细胞中显著下调。3.应用RT-qPCR技术进一步验证hsa_circ_0001931、hsa_circ_0001313、hsa_circ_0000817是否有助于鉴别HC和RA患者,收集53例初诊RA患者、37例复诊RA患者和38例HC外周血CD4+T细胞,通过RT-qPCR检测上述三种circRNA的表达水平,统计分析后发现,hsa_circ_0000817在RA患者外周血CD4+T细胞中的表达水平显著高于HC,且初诊RA患者CD4+T细胞中hsa_circ_0000817的表达水平显著高于复诊RA患者,但是hsa_circ_0001931、hsa_circ_0001313的表达水平在HC和RA患者外周血CD4+T细胞中无明显差异。4.通过RT-qPCR技术检测HC和RA患者CD4+T细胞上m~6A修饰酶相关基因是否有差异性表达。结果显示在初诊RA患者CD4+T细胞上ALKBH5的表达水平明显高于HC,且分析初诊和复诊RA患者发现,ALKBH5在初诊RA患者的CD4+T细胞上表达水平明显高于复诊RA患者,而YTHDF2、FTO、WTAP、METTL3和METTL14等其他m~6A相关基因在HC和初诊RA患者CD4+T细胞上的表达水平无明显差异。在此基础上,收集RA患者的临床实验室指标,分析发现初诊RA患者CD4+T细胞上ALKBH5的表达水平和类风湿因子呈正相关。5.上述实验检测RA患者CD4+T细胞上m~6A甲基化相关基因和hsa_circ_0000817的表达水平后,经相关性分析发现hsa_circ_0000817的表达水平分别和ALKBH5、YTHDF2的表达水平呈正相关。6.通过流式细胞术检测HC和RA患者外周血Th17%,结果表明RA患者外周血中Th17%显著高于HC,同时,RA患者CD4+T细胞中hsa_circ_0000817表达水平和Th17%呈正相关。研究结论:1.与HC相比,RA患者外周血CD4+T细胞中m~6A修饰circRNA表达谱存在差异,且Me RIP-qPCR证实hsa_circ_0000817的m~6A修饰水平在RA患者外周血CD4+T细胞中显著下调,提示RA患者CD4+T细胞中存在异常表达的m~6A修饰circRNA。2.hsa_circ_0000817在RA患者和HC外周血CD4+T细胞中有差异性表达,且与治疗水平相关,提示hsa_circ_0000817可能在RA的发生发展中发挥重要作用,可能作为RA治疗的生物标志物或靶点。3.与HC相比,ALKBH5在RA患者CD4+T细胞中表达显著增高,且与hsa_circ_0000817的表达水平呈正相关,提示ALKBH5介导的hsa_circ_0000817m~6A修饰可能影响hsa_circ_0000817的表达。4.RA患者外周血中Th17%显著高于HC,且hsa_circ_0000817的表达水平与Th17%呈正相关,说明ALKBH5介导的m~6A修饰hsa_circ_0000817可能通过调节Th17细胞应答,影响RA疾病的发生发展。