由创伤、感染、肿瘤引起的骨缺损是骨科临床治疗的棘手问题，采用传统的自体骨或同种异体骨移植及生物材料填充，由于存在种种弊端，治疗效果均不理想，限制了其临床广泛应用。组织工程技术的兴起为解决这一难题提供了新的思路，成为近年的研究热点。其中种子细胞与生物材料是组织工程研究的核心问题。本研究将成人骨髓基质干细胞(human bone marrow stromal cells，HBMSC)在体外培养并诱导分化为成骨细胞后，与珊瑚羟基磷灰行(coral hydroxyapatite，CHA)复合培养，观察其在体外生长情况，并将复合物植入裸鼠体内，观察其异位成骨能力；此外，还采用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因转染骨髓源成骨细胞作为示踪标记，为进一步研究提供实验依据。 【目的】 (1)将来源于成人骨髓、具有多向分化潜能的骨髓基质干细胞，在特定的条件下定向诱导分化为成骨细胞，观察其生物学特性，探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性和应用价值。 (2)观察HBMSC与CHA在体外复合培养条件下的生长情况及生物相容性，为骨组织工程选择适宜的种子细胞载体。 (3)研究成骨细胞在CHA支架材料上复合培养后构建的组织工程化骨组织的体内异位成骨能力，探讨适宜的组织工程化骨组织的构建方式。 (4)观察经腺病毒介导的GFP转染的成骨细胞的生物学特性，探讨GFP作为组织工程种子细胞示踪剂的可行性。 【方法】 (1)抽取健康成人骨髓采用全骨髓法进行培养扩增，传代后改用含第一军医大学硕十研究生学位论文地塞米松(10一smouL)、日一甘油磷酸钠(一ommo比)和维生e(somg/L)的条件培养基促使其向成骨细胞定向诱导分化。在相差显微镜、HE染色光镜、扫描与透射电镜下观察细胞形态及超微结构，并测定培养细胞的生长曲线(MTT法)，流式细胞术进行细胞表面特征鉴定，免疫组化检测I型胶原，Gomori钙钻法进行ALP染色、Von Kossa法进行钙结节染色，同时测定细胞内ALP含量变化。 (2)将已定向诱导分化的成人成骨细胞单独或与CHA复合培养，不同时间用倒置相差显微镜、HE染色光镜及扫描电镜观察，MTT法测定细胞生长曲线，并进行细胞微量蛋白含量和碱性磷酸酶的定量检测。 (3)将已定向诱导分化的成人成骨细胞种植于CHA上，复合培养5一7d后植入裸鼠体内，4、8、12周取材作一般观察、X线摄片观察、组织学检查和源于成人的ALP及ocN的RT一PcR检测。 (4)以腺病毒为载体，293A细胞为包装细胞，介导GFP转染成人骨髓源成骨细胞，在相差显微镜和荧光显微镜下观察，流式细胞术检测其表达效率;并将转染后的成骨细胞植入裸鼠肌袋内，2周和4周后取材进行检测。【结果】 (1)原代和传代培养的细胞具有活跃的增殖能力，诱导培养2一3周后，细胞生长良好，生化指标稳定，光镜和扫描电镜下表现出与典型的成骨细胞相似的形态特征，透射电镜下见大量扩张的粗面内织网、高尔基体和线粒体，细胞核较为幼稚。流式细胞术证明HBMSC细胞膜抗原CD29、CD44、CD 105表达阳性，而CD14、CD34 and HLA一DR表达阴性，I型胶原染色、ALP及钙结节染色等均为强阳性;ALP活性明显增强(尸<0 .01)。 (2)成人骨髓源成骨细胞与CHA复合培养时生长良好，增殖迅速，表现出典型成骨细胞的形态特征和生物学特性;CHA具有三维多孔结构，有利于细胞的贴附、生长与增殖，并对细胞的功能无不良影响。 (3)实验组术后4、8和12周均有新骨形成，随着时间延长，新骨生成量增多，对照组则无新骨形成;实验组术后4周RT一PCR结果显示源于人的碱性磷酸酶及骨钙素表达均为阳性，对照组为阴性。第一军医大学硕十研究生学位论文 (4)GFP基因转染的骨髓源成骨细胞24h可见细胞表达绿色荧光，48h荧光增强，转染阳性率达82.14%，转染后细胞的表面抗原标志CD29、CD44高效表达，而CD34不表达，仍然具有HBMSC的特性。GFP在裸鼠体内2周和4周均得到了明显表达，且未影响转染细胞的功能状态。【结论】 (1) HBMSC取材安全方便，在特定条件诱导下，可定向诱导分化为具有典型形态学特点和功能的成骨细胞，HBMSC可作为理想的骨组织」_二程种子细胞来源。(2) CHA具有二维多孔结构，有利于成骨细胞的贴附、生长与增殖，并对细胞的功能无不良影响，是较理想的骨组织_L程支架材料。(3)将成骨细胞与CHA复合培养后构建的组织工程化骨组织，具有异位成骨能力，可望应用于临床修复骨缺损。(4) GFP能有效转染成骨细胞，是一种可用于组织工程研究的敏感的活细胞示踪剂。