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十二指肠贾第虫(又称为蓝氏贾第虫,肠道贾第虫)是一种具有双核的单细胞真核厌氧微生物,通常在全球范围内引起腹泻疾病。十二指肠贾第虫分布广泛,十二指肠贾第虫病在世界范围内流行或暴发流行,是十种主要危害人类健康的寄生虫病之一。十二指肠贾第虫最常见的传播方式为水源传播,常在在旅行者中爆发,故被称为“旅行者腹泻”。十二指肠贾第虫能够感染人和多数哺乳动物,故国际上认定为该病为重要的人兽共患寄生虫病。十二指肠贾第虫虫体内结构简单,只有非常简单的内膜系统以及特殊的双细胞核结构,够实现“永生化”的体外纯培养及传代,属于早期真核生物,在生物进化史中具有重要地位,是理想的“模式生物”。细胞永生化是当前细胞生物学研究的热点之一。目前研究认为细胞永生化与端粒密切相关,端粒(Telomere)是一种特殊核蛋白复合体,能够稳定染色体结构。随着对端粒和端粒酶研究的深入,发现一些端粒酶相关蛋白质在对端粒酶活性调节方面具有重要作用。十二指肠贾第虫滋养体的双核大小形态都很相似,已有研究表明二者DNA含量相同,在复制、转录、有丝分裂等生命活动中时同步的。但这仍不能说明两细胞核是完全相同的,比如是否均存在端粒酶及其活性调节机制尚不清楚。在本实验室前期研究中,通过酵母双杂交筛选系统发现十二指肠贾第虫复制因子C-亚基1(RFC1)能够与端粒酶在体外互作,并通过体外蛋白互作技术得到验证。故本实验进一步探讨RFC1和端粒酶体内互作验证和RFC1对端粒酶活性的调节作用研究,为深入阐释十二指肠贾第虫端粒酶活性调节机制,细胞周期调控或生存策略提供实验支撑。RFC1和端粒酶在细胞内的互作:通过修改双分子荧光互补系统,构建重组质粒pbTRBD-HA-KN151和pbRFC1-Myc-LC151,并将其电击转染进入293T细胞,经过24h培养后,激光共聚焦显微镜观察到在293T细胞细胞核内产生红色荧光,这说明RFC1和端粒酶能够在细胞内发生互作。RFC1和端粒酶在十二指肠贾第虫内的互作定位:通过制备兔源RFC1和鼠源端粒酶多克隆抗体,使用Duolink?PLA技术在十二指肠贾第虫体内验证RFC1和端粒酶的相互作用,并发现十二指肠贾第虫双核内均有红色荧光,说明两细胞核内同时存在端粒酶,进一步表明了双核的等同性。核酶体外切割效率研究:根据嵌合型锤头状核酶特性,设计构建针对RFC1转录体的核酶,用于降低RFC1表达量。在体外RFC1转录体切割实验中,所构建的十二指肠贾第虫病毒载体介导的核酶对其切割效率达到87.26%。说明该核酶系统能够有效降低RFC1表达量,能够满足后续实验要求。RFC1对端粒酶活性的调控作用:将十二指肠贾第虫病毒载体介导的嵌合型锤头状核酶电击转染进入十二指肠贾第虫,并获得具有潮霉素抗性的十二指肠贾第虫虫株。通过Real-time PCR检测到pC631-RFC1(A)-pac虫株的RFC1转录本含量明显下降,只有野生虫株的31.2%,且虫体计数结果显示其生长速率明显降低。端粒酶活性检测显示,pC631-RFC1(A)-pac虫株端粒酶活性明显低于野生虫株。实验结果表明在十二指肠贾第虫滋养体内RFC1含量降低能够降低滋养体繁殖速率,调低端粒酶活性。综上所述,我们通过十二指肠贾第虫体内蛋白互作定位发现两细胞核内同时存在端粒酶,进一步表明了双核的等同性。首次发现RFC1蛋白能够调控端粒酶活性,为进一步探讨十二指肠贾第虫端粒酶活性调节机制及对十二指肠贾第虫“永生化”的影响奠定基础。