研究背景:甲状腺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,特别是在中国、日本、韩国等地区多发,严重影响着人民的身体健康。甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma,PTC）是甲状腺恶性肿瘤最常见病理类型,占甲状腺癌的90%。在PTC中,60%以上的病人有区域淋巴结浸润或转移。对于PTC,传统的治疗方法只有手术根治。然而对于晚期PTC或有广泛远处转移,病人往往不能手术,且多伴有碘难治性特征,或失去根治术机会而只能采用估息手术,预后较差。近年来,关于甲状腺癌的基因研究包括突变/非突变基因位点的研究,包括BRAF/MAPK、TERT prometer、PI3K、mTOR和/或络氨酸激酶受体Ret,EGFR,HGF/SF 受体、胰岛素\胰岛素样受体等。但国际上迄今为止,一直没有确证出PTC高效、敏感的分子诊疗靶标以指导临床实践;目前国际指南中尚缺乏关于PTC诊疗的可靠分子靶点和靶向药物。因此,进一步通过全基因组测序、转录组测序等技术分析,挖掘PTC的全基因组特征及关键癌基因、抑癌基因的表达异常并分析其对PTC的作用机制,将对PTC的发病机制、发现新分子诊疗靶点提供实验研究的基础,具有重要的科学意义和临床应用价值。中心体是动物细胞内重要的微管组织中心（mircotubule organization center,MTOC）为许多细胞器发挥功能提供了基础。其结构为一对中心粒（centriole）和中心粒周围物质（pericentriolar material,PCM）。超微结构显示中心粒是有9组三联体微管（micro-tubule）按一定的角度排列形成的圆筒状结构。两个中心体以近端靠近垂直排列,形成中心体的基本结构。细胞间期时中心体的2个中心粒在结构上有所不同,其中在远端具有附属结构的中心粒被称为母中心粒（mother centriole,MC）,另一个称为子中心粒/摇篮体（daughter centriole）。生理情况下,中心粒的复制主要以母中心粒依赖的方式（mother centriole dependent,MCD）进行复制合成,即以一个母中心粒前体来合成新的中心粒,而Sorokin和Anderson两个研究组发现了不依赖于MC的“从头合成”（de novo）的环装结构扩增,即摇篮体依赖（deutersome-dependent,DD）的方式。MCD的合成方式为Cep63 和Cep152在母中心粒的基底部分形成环状骨架,进而招募Plk4分子为中心体合成提供定位点,然后招募Sas-6分子以启动中心粒的复制。Khodjakov、Huijie Zhao等人发现,Cep63和Cep152形成的环状结构与电镜观察到的摇篮体有一定的结构类似性,推测MCD和DD的中心粒复制方式共享了部分分子机制和关键基因;某个或某几个中心粒复制相关的关键调控基因存在旁系同源基因（paralog）,不同的同源基因分别介导了MCD和DD途径的中心粒扩增。而中心粒过多、中心粒结构混乱、中心粒长度异常、中心粒相关蛋白磷酸化等现象与许多肿瘤的发生发展有关,且可能与癌细胞高有丝分裂指数及高侵袭性直接相关。Lingle等首次在乳腺癌中发现了中心体异常扩增、中心体蛋白异常磷酸化等现象。在Hela细胞株及骨肉瘤细胞U2OS的研究中均发现了中心粒异常扩增的证据。目前广泛接受的机制为:在有丝分裂间期,被招募到已有中心粒周围的蛋白,如Plk4、Sas-6、SIL\STIL等浓度异常升高,导致了中心粒的非正常扩增。近年来研究证明,中心体的数目受到自噬的调节。关于自噬调控中心体数目的具体机制,目前尚不完全清楚。Shigeomi Shimizu等人在2016年的一份研究报告中认为,Cep63蛋白通过与p62的锌指结构结合被自噬泡吞噬,随后被P62的泛素化结构域介导进行泛素化降解,以维持正常的中心体数目。目前被大多数研究者广泛认可的观点认为:自噬参与甲状腺癌的起始、进展和转移等各个阶段,且在不同阶段自噬对甲状腺癌细胞的影响是不完全相同的。在甲状腺癌起始阶段,自噬主要通过上调Atg及其对应的蛋白家族来清除细胞内的活性氧和有缺陷的蛋白质、细胞器。这个阶段,自噬主要抑制肿瘤的发生。在甲状腺癌进展阶段,自噬主要起到维持甲状腺癌的恶性程度及癌细胞增殖的作用。此外,关于自噬与甲状腺癌转移的关系仍需要进一步的实验数据来支持,目前已有的研究猜想自噬可能通过自噬调节基因（Beclin-1）以及上皮细胞间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）来影响甲状腺癌的侵入和转移。但 目前关于甲状腺癌中自噬活动如何调控中心体数目使得肿瘤细胞获得持续稳定的恶性生物学行为的研究仍为空白。本研究旨在探讨CCDC67基因发挥抑癌作用的分子机制与下游关键基因CEP63在甲状腺乳头状癌中的生物学功能。本课题内容由以下四部分组成:第一部分,CCDC67基因对PI3K/AKT/mTOR通路的调控效应研究;第二部分,CCDC67基因对细胞自噬的影响;第三部分,CCDC67旁系同源基因CEP63基因的生物学功能探讨;第四部分,CCDC67基因对CEP63基因的表达调控效应分析。第一部分 CCDC67基因对PI3K/AKT/mTOR通路的调控效应研究目的:本课题组前期的研究发现,CCDC67基因是甲状腺乳头状癌中的抑癌基因。该基因的失活,可能是甲状腺乳头状癌发生发展的重要原因之一,同时也与BRAFV600E突变存在关联。但是,CCDC67基因在甲状腺乳头状癌中如何发挥其抑癌功能尚有待进一步研究。本部分研究旨在通过蛋白组学、转录组学测序技术来探索CCDC67基因过表达后带来的下游基因表达变化,初步解析CCDC67基因的抑癌机制。方法:1.构建慢病毒Lenti-CCDC67-Luciferase-Puromycin质粒,经过细胞转染后,利用嘌呤霉素筛选并构建CCDC67基因稳定过表达的甲状腺TPC-1细胞株。2.利用相对和绝对定量同位素标记（isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ）蛋白组学技术对过表达CCDC67基因前后的TPC-1细胞株进行检测,分析该基因过表达前后蛋白水平表达的变化。利用Metascape对分析数据进行Reactome、CORUM、KEGG和GO数据库整合富集分析。3.利用转录组学（RIP-RNA-seq）技术对过表达CCDC67基因前后的TPC-1细胞株进行转录组学检测,分析该基因过表达前后转录水平表达的变化;利用Metascape对分析数据进行Reactome、CORUM、KEGG和GO数据库整合富集分析。4.收集指数增长期的TPC-1细胞、CCDC67OE细胞和NC细胞,提取细胞总蛋白后,通过western-blot法对蛋白组学、转录组学分析结果中PI3K蛋白、AKT蛋白、mTOR蛋白进行检测验证。5.数据处理应用统计学软件SPSS22.0和Graphpad完成。两组数据比较采用t检验,三组及以上数据相关指标的比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验;不符合方差齐性或正态分布的,采用非参数检验;P＜0.05为差异有统计学意义。结果:1.通过iTRAQ蛋白组学技术对过表达CCDC67前后的TPC-1细胞株进行检测分析,我们共发现差异表达肽段31307个,蛋白6000个。根据KEGG通路分析mTOR信号通路呈现出表达变化差异。2.通过RIP-RNA-seq转录组组学测序技术对过表达CCDC67前后的TPC-1细胞株进行检测分析,共发现差异表达的circRNA 1865个,其中上调1008个,下调857个;发现差异表达的lncRNA28213个,其中上调7554个,下调20659个;发现差异表达的mRNA 84573个,其中上调3494个,下调4936个。Metascape整合富集分析发现,差异表达的circRNA的功能集中于细胞微管、细胞器、细胞骨架、细胞周期方面,同时可见PI3K-Akt通路、Cell cycle（细胞周期）、MAPK通路等出现差异富集。3.对PI3K/Akt通路的western blotting分析显示,过表达CCDC67后,PI3K表达显著抑制,而mTOR表达显著上调,但Akt表达无显著变化（PI3K:TPC-1 vs.NC,p=0.022;TPC-1 vs.CCDC67OE,p=0.010;CCDC67OE vs.NC,p=0.002.AKT:TPC-1 vs.NC,p=0.741;TPC-1 vs.CCDC67OE,p=0.899;CCDC67OE vs.NC,p=0.948.mTOR:TPC-1 vs.NC,p=0.915;TPC-1 vs.CCDC67OE,p=0.006;CCDC67OE vs.NC,p=0.009.）结论:过表达CCDC67在甲状腺乳头状癌中的功能呈现多样化。其功能可能涉及细胞周期的调控、细胞器的合成和微管组织中心形成等细胞生命活动的诸多方面。同时,CCDC67的过表达对PI3K/AKT/mTOR信号通路传导产生了一定影响,但PI3K与mTOR的表达呈现非一致性变化与某特定生物表型的关系仍有待进一步探究。第二部分 CCDC67基因对细胞自噬的调控效应分析目的:我们在实验偶然中发现CCDC67基因过表达后,出现了自噬标志结构（自噬体与自噬溶酶体）在细胞质中的增加。同时,细胞自噬也是PI3K/AKT/mTOR信号传导通路下游的一项重要细胞活动。由此,我们尝试通过自噬作为另一个切入点探索CCDC67基因的功能机制,通过更完善的实验手段和方案来检测CCDC67基因对细胞自噬带来的影响。方法:1.取指数增长期的TPC-1、CCDC67OE、NC细胞株,转染过表达SensGFP-StuBRFP-LC3的慢病毒,24H后经嘌呤霉素筛选。取筛选后的细胞1 × 104/ml接种于96孔板中,加入Hochest-33342染色,并置于CQ1中进行三通道荧光扫描（SenGFP、StubRFP和Hochest）,计数对红、绿点计数计算比之后,评估自噬流水平。2.利用细胞刮刀收集指数增长期的TPC-1细胞、CCDC67细胞及空载体转染细胞NC,生理盐水漂洗后,用1%的戊二醛固定30分钟后,制作玻片进行透射电镜观察及拍摄,标注细胞器结构,对自噬体（Autophagosome,AP）与自噬溶酶体（Autophagolysosome,ASS）进行计数。3.收集指数增长期的TPC-1细胞、CCDC67OE细胞和NC细胞,提取细胞总蛋白后,通过western-blot法对自噬标志物LC3进行检测,结果采用ImageJ进行灰度分析。4.数数据处理应用统计学软件SPSS22.0和Graphpad完成。两组数据比较采用t检验,三组及以上数据相关指标的比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验;不符合方差齐性或正态分布的,采用非参数检验;P＜0.05为差异有统计学意义。结果:1.自噬流监测结果显示,CCDC67过表达导致自噬通量增强,其中自噬相对红绿点计数显示自噬体向自噬溶酶体的动态转化过程（TPC-1 vs.NC,p=0.9148;TPC-1 vs.CCDC67OE,p=0183;CCDC67OE vs.NC,***p＜0.0481）。2.经透射电镜观察:与TPC-1组和阴性对照组相比,CCDC67OE组细胞中自噬体和自噬溶酶体数量明显增加（TPC-1 vs.NC,p=0.891;TPC-1 vs.CCDC67OE,p=0.001;CCDC67OE vs.NC,***p＜0.001.）。3.经western blotting检测显示,CCDC67OE组的LC3蛋白相较于TPC-1组、NC组和Nthy-roi 3-1组呈现出显著的高表达（TPC-1 vs.NC,p=0.9148;TPC-1 vs.CCDC67OE,p=0183;CCDC67OE vs.NC,p=0.027,TPC-1 vs.Nthy-ori 3-1,p=0.341;NC vs.Nthy-ori 3-1,p=0.472;CCDC67OE vs.Nthy-ori 3-1,p=0.223）。结论:在甲状腺乳头状癌TPC-1细胞株中,过表达CCDC67基因可引起细胞自噬水平显著升高。参考于正常甲状腺滤泡上皮细胞中较高的自噬水平,我们推测细胞自噬水平的升高是CCDC67基因逆转甲状腺乳头状癌恶性表型的重要一环。而细胞自噬作用的靶点,仍需要后续研究进行探索挖掘。第三部分 CCDC67旁系同源基因CEP63的临床表达及肿瘤生物学功能探讨目的:在第一部分的转录组测序中,我们关注到了CEP63基因的差异表达。且经检索发现,CCDC67与CEP63是结构和功能相似的旁系同源基因（paralogue gene）,且分别主导了中心体复制的两个途径,即CCDC67主导子中心体依赖途径（Deutersome Dependent,DD）,CEP63 主导母中心体依赖途径（Mother Centrosome Dependent,MCD）。基于两基因间这样的联系,我们在此部分首先关注了CEP63在甲状腺乳头状癌中的表达情况和生物学功能,同时在后续尝试探索CCDC67基因与CEP63基因直接是否存在可能的调控机制关系。方法:1.收集24例,2018年3月-5月郑州大学第一附属医院甲状腺外科甲状腺乳头状癌患者的癌灶组织,提取总RNA并进行RT-PCR,最后利用凝胶电泳验证CEP63和CCDC67基因表达产物在甲状腺乳头状癌组织中的存在性。2.利用Cas9/CRISPR技术,构建CEP63敲除的甲状腺乳头状癌细胞株,经嘌呤霉素筛选后,进行单克隆培养扩增,最后利用测序技术验证KO敲除位点、western blotting法验证CEP63KO效率。3.利用 Affymetrix 公司的 GeneChip primeview human 表达谱芯片对 CEP63KO后的差异表达基因进行分析,同时在原分析基础上利用利用Metascape对分析数据进行Reactome、CORUM、KEGG和GO数据库整合富集分析,探讨CEP63的生物学功能及下游可能的调控靶点。4.根据表达谱芯片分析结果,利用Transwell迁移实验、流式周期检测对CEP63基因的生物学功能进行初步分析。5.利用CEP63敲除的甲状腺乳头状癌细胞株与空白对照细胞株TPC-1进行裸鼠皮下荷瘤实验,对CEP63基因的体能增殖能力进行生物学分析。待瘤体可见后,隔日检测瘤体体积,记录裸鼠体重。于瘤体达20mm后处死裸鼠,测量瘤体重量、终末体积。6.取裸鼠皮下荷瘤实验的瘤体,于福尔马林溶液固定后,制作免疫组织芯片。根据前述表达谱芯片中的通路富集结果,进行PI3K、CyclinD、DDI3T、CREB、BAD、mTOR蛋白的免疫组织化学染色,染色结果利用ImageJ计算平均光密度（Integrated Optical Density,IOD）后进行统计分析。7.数据处理应用统计学软件SPSS22.0和Graphpad完成。三组及以上数据相关指标的比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验;不符合方差齐性或正态分布的,采用非参数检验;P＜0.05为差异有统计学意义。结果:1.24例甲状腺乳头状中,均检测出CCDC67与CEP63基因的mRNA表达。2.成功利用Cas9/CRISPR构建了CEP63敲除的TPC-1细胞株CEP63KO,并通过嘌呤霉素筛选和单克隆培养获得了 2个与14个碱基缺失的稳定敲除的细胞株。随后,KO效率被测序和western blotting验证。3.CEP63KO与TPC-1细胞经GeneChip primeview human表达谱芯片对比检测,发现差异表达基因1301个。其中在经典通路富集分析中Endocannabinoid Cancer Inhibition Pathway（内源性大麻素肿瘤抑制途径）被显著激活,Z-score为3.771;在差异基因在疾病与功能中的显著性富集分析中肿瘤、机体损伤和异常、细胞移动和细胞死亡等通路被提示明显富集,其热图显示CEP63基因敲除后Cell movement of cancer cells被显著抑制（Z-score=-2.994）。Endocannabinoid Cancer Inhibition Pathway（内源性大麻素肿瘤抑制途径）中的关键分子PI3K、mTOR、CREB、CyclinD等分子被显著抑制,而CDH1（E-cadhrin）、NUPR1、DDIT3、TRIB3等分子被提示显著激活。Metascape分析显示,CEP63敲除后差异表达基因在 ameboidal-type cell migration、negative regulation of cell proliferation、regulation of MAPK cascade等方面出现富集。4.Transwell迁移实验结果显示,CEP63基因敲除后,TPC-1细胞的迁移能力显著下降（Transwell experiment:TPC-1 vs.CEP63KO,p=0.0319）;流式细胞术周期检测结果显示,CEP63基因敲除后,TPC-1细胞的周期进程呈现出显著的S期阻滞和G2 期比例下降（G1 phase:TPC-1 vs.CEP63KO,p=0.0810;S phase:TPC-1 vs.CEP63KO,****p＜0.0001;G2/M phase:TPC-1 vs.CEP63KO,****p＜0.0001）5.裸鼠荷瘤实验结果显示,CEP63基因敲除后,TPC-1细胞的体内成瘤及增殖能力受到明显抑制,瘤体终末体积和瘤体重量显著下降（Xenograft model:tumor weight:TPC-1 vs.CEP63KO,****p＜0.0001;tumor volume:TPC-1 vs.CEP63KO,****p＜0.0001.）。6.荷瘤实验瘤体组织免疫组织芯片染色结果显示:相较于TPC-1组,CEP63KO组中PI3K/cyclinD的表达明显降低,DDIT3的表达明显升高,而CREB/BAD/mTOR的表达变化在TPC-1组与CEP63KO组之间未见明显差异（PI3K:TPC-1 vs.CEP63KO,p=0.0116;cyclinD:TPC-1 vs.CEP63KO,p=0.0116;TPC-1 vs.CEP63KO,p=0.0002;DDIT3:TPC-1 vs.CEP63KO,p=0.0086;CREB:TPC-1 vs.CEP63KO,p=0.1612;BAD:TPC-1 vs.CEP63KO,p=0.7944;mTOR:TPC-1 vs.CEP63KO,p=0.3337.）。结论CEP63基因在甲状腺乳头状癌细胞株TPC-1的恶性生物学维持中起到至关重要的作用,其敲除可明显抑制肿瘤细胞周期进程和细胞活动。这一点,与其旁系同源基因CCDC67呈现出完全不同的生物学功能。这些关于CEP63的生物学表型的数据也就证明CEP63基因主导的MCD中心体复制途径,是甲状腺乳头状癌细胞复制所需中心体的主要、甚至唯一合成途径。第四部分 CCDC67基因过表达对CEP63基因的表达调控及机制分析目的:在第一、第二部分,我们从不同角度探讨了CCDC67基因在甲状腺乳头状癌中发挥抑癌功能的潜在机制,包括对PI3K/AKT/mTOR通路的调控、对细胞自噬的影响。第三部分中,我们发现CCDC67基因的旁系同源基因在甲状腺乳头状癌中具有完全不同的生物学效应以及其在甲状腺乳头状癌的恶性增殖中起到的关键作用。在此基础上,我们在第四部分尝试挖掘了前三部分内容的关系,分析它们内在的联系与更深层的机制,即CCDC67基因是如何对CEP63基因表达的实现调控的。方法:1.另收集21例,2018年9月-11月郑州大学第一附属医院甲状腺外科甲状腺乳头状癌患者的癌与癌旁非癌组织,提取总RNA并进行Realtime-PCR,检测CCDC67基因、CEP63基因的表达水平。同时,分析不同临床病理分期的甲状腺乳头状癌患者的癌与癌旁组织中CCDC67基因与CEP63基因的表达关系。2.利用Western-blot法检测甲状腺滤泡上皮细胞Nthy-ori 3-1、甲状腺乳头状癌中BRAF V600E突变细胞株B-CPAP与BRAF V600E非突变株TPC-1中的CCDC67基因与CEP63基因表达情况。3.利用Western-blot法检测CCDC67基因过表达前后,TPC-1细胞株中CEP63的表达情况,结果采用ImageJ进行灰度分析。4.对CCDC67过表达细胞株、CEP63敲除细胞株、TPC-1细胞株中的CEP63和γ-tubulin以及细胞核进行荧光标记,同时利用激光共聚焦显微镜捕捉的静止时相和分裂时相上述细胞,分析其中的蛋白表达定位、中心体形态及细胞核分裂状态等,特别分析与γ-tubulin结合的结合态CEP63蛋白以及细胞质中的游离态CEP63。5.利用自噬激动剂雷帕霉素10nM,巴弗洛霉素A1 10nM浓度,处理TPC-1细胞 24H后,利用western blotting法检测其中CEP63、LC3、Beclin1、mTOR的蛋白表达水平,结果采用ImageJ进行灰度分析。6.分别利用TPC-1细胞、雷帕霉素干预的TPC-1细胞及CEP63敲除的TPC-1细胞（CEP63KO）进行平板集落形成实验,于48H后拍照,并采用ImageJ对集落面积进行测量。7.分别利用TPC-1细胞、雷帕霉素干预的TPC-1细胞（TPC-1+Rapa）、CCDC67过表达的TPC-1细胞（CCDC67OE）和空载体转染细胞（NC）进行Balb/c裸鼠荷瘤实验。待瘤体可见后,隔日检测瘤体体积,记录裸鼠体重。于瘤体达20mm后处死裸鼠,测量瘤体重量、终末体积并计算抑瘤率。8.数据处理应用统计学软件SPSS22.0和Graphpad完成。三组及以上数据相关指标的比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用L5D-t检验;不符合方差齐性或正态分布的,采用非参数检验;P＜0.05为差异有统计学意义。结果:1.分析21例PTC患者及其周围正常组织的CCDC67和CEP63的mRNA表达发现:在PTC组织中CEP63的表达显著增加,而在其周围正常组织中CEP63的表达显著减少。而CCDC67的表达恰恰相反。此外,在PTC组织中CEP63的表达高于CCDC67,而在癌旁正常组织中CEP63的表达相对低于CCDC67（CEP63:PTC vs.Normal tissue,p=0.0021;CCDC67:PTC vs.Normal tissue,p=0.0247;Normal tissues:CEP63 vs.CCDC67,p=0.0145;PTC:CEP63 vs.CCDC67,p=0.0047）。2.使用蛋白免疫印迹分析CEP63和CCDC67基因在细胞系中的表达（TPC-1/B-CPAP/Nthy-ori 3-1）发现,CEP63在TPC-1和B-CPAP细胞系中,相较于CCDC67基因显示出较高的表达水平,但其灰度统计结果分析只有TPC-1细胞中的差异具有显著性（TPC-1:CEP63 vs.CCDC67,p=0.001;B-CPAP:CEP63 vs.CCDC67,p=0.289;Nthy-ori 3-1:CEP63 vs.CCDC67,p=0.930）。3.使用蛋白免疫印迹分析过表达CCDC67基因后CEP63基因的表达发现:相较于TPC-1组NC组,CCDC67OE组的CEP63蛋白表达量显著下降（CCDC67:TPC-1 vs.NC,p=0.008;TPC-1 vs.CCDC67OE,p=0.001;CCDC67OE vs.NC,p=0.048.）。4.细胞免疫荧光共聚焦分析发现:CEP63蛋白主要存在于细胞质,并形成大小均一的点状聚集,少数位于核周。在TPC-1组,除了与γ微管蛋白结合的CEP63蛋白,游离态的CEP63蛋白过度表达且异常积累并分散在细胞质中。CCDC67OE组,在G1/S期的时,CEP63蛋白位多于细胞质,而有丝分裂期时该蛋白则部分分布于核周细胞质,其余游离态的CEP63荧光呈现明显的凝集和聚合,形成较大的荧光聚集点。在有丝分裂的早期阶段,CEP63蛋白与γ-微管蛋白结合形成中心体,为染色体分离提供驱动力。在CCDC67OE和CEP63基因敲除（KO）组中,CEP63的红色荧光计数明显减少（TPC-1 vs.CCDC67OE,p=0.013;TPC-1 vs.CEP63KO,p=0.003;CCDC67OE vs.CEP63KO,p=0.724）。特别在CEP63KO组中,我们难以捕获分裂期的细胞,但观察到了由中心体缺失或功能障碍引起的染色体不对称分裂及细胞分裂中止。5.蛋白免疫印迹分析结果显示,经自噬抑制剂巴非霉素A1处理组的CEP63蛋白表达显著升高,经雷帕霉素处理组的CEP63表达显著降低。与其他组比较,巴非霉素A1处理组LC3显著高表达;CEP63KO组的LC3也明显高于nrhyi-ori 3-1和rapamycin治疗组。Beclin1的结果与LC3相似。mTOR蛋白在Nthy-ori-1和rapamycin处理的TPC-1细胞中表达显著降低,而在bafilomycin处理的TPC-1细胞中表达显著升高（CEP63:TPC-1+Rapa vs.Nthy-ori 3-1,p=0.0759;TPC-1+Baf vs.Nthy-ori 3-1,p=0.0017;CEP63KO vs.Nthy-ori 3-1,p=0.0604;TPC-1+Baf vs.TPC-1+Rapa,p=0.0173;CEP63KO vs.TPC-1+Rapa,p=0.2217;CEP63KO vs.TPC-1+Baf,p=0.0182.LC3:TPC-1+Rapa vs.Nthy-ori 3-1,p=0.9729;TPC-1+Baf vs.Nthy-ori 3-1,p=0.0294;CEP63KO vs.Nthy-ori 3-1,p=0.0334;TPC-1+Baf vs.TPC-1+Rapa,p=0.0086;CEP63KO vs.TPC-1+Rapa,p=0.0397;CEP63KO vs.TPC-1+Baf,p=0.3333.Beclin1:TPC-1+Rapa vs.Nthy-ori 3-1,p=0.9999;TPC-1+Baf vs.Nthy-ori 3-1,p=0.0015;CEP63KO vs.Nthy-ori 3-1,p=0.0056;TPC-1+Baf vs.TPC-1+Rapa,p=0.0015;CEP63KO vs.TPC-1+Rapa,p=0.0060;CEP63KO vs.TPC-1+Baf,p=0.6700.mTOR:TPC-1+Rapa vs.Nthy-ori 3-1,p=0.9999;TPC-1+Baf vs.Nthy-ori 3-1,p=0.0040;CEP63KO vs.Nthy-ori 3-1,p=0.7283;TPC-1+Baf vs.TPC-1+Rapa,p=0.0038;CEP63KO vs.TPC-1+Rapa,p=0.7096;CEP63KO vs.TPC-1+Baf,p=0.0150）。6.集落形成实验中,CEP63KO组和雷帕霉素处理的TPC-1细胞组集落大小、数量及平均克隆形成率明显低于TPC-1组（TPC-1 vs.TPC-1+Rapa,****p＜0.0001;TPC-1 vs.CEP63KO,****p＜0.0001;TPC-1+Rapa vs.CEP63K,***p＜0.001.）。7.裸鼠荷瘤实验结果显示,雷帕霉素组和CCDC67OE组均有明显的抑瘤作用,相较于TPC-1和NC组,雷帕霉素处理组和CCDC67OE组的瘤体重量、体积及增殖曲线受到显著抑制（Tumor weight:TPC-1 vs.NC,p=0.9320;TPC-1 vs.CCDC670E,p=0.0061;TPC-1 vs.TPC-1+Rapa,***p＜0.001;NC vs.CCDC67OE,p=0.0226;NC vs.TPC-1+Rapa,***p＜0.001;CCDC67OE vs.TPC-1+Rapa,p=0.365.Tumor volume:TPC-1 vs.NC,p=0.7764;TPC-1 vs.CCDC670E,****p＜0.0001;TPC-1 vs.TPC-1+Rapa,****p＜0.0001;NC vs.CCDC67OE,***p＜0.001;NC vs.TPC-1+Rapa,***p＜0.001;CCDC67OE vs.TPC-1+Rapa,p=0.9999）。结论:在甲状腺乳头状癌中,CEP63的高表达与CCDC67的低表达水平存在一定联系。CCDC67基因的过表达可引起CEP63的表达下降,进而实现逆转TPC-1细胞的恶性肿瘤生物学特征。通过雷帕霉素、巴弗洛霉素A1干预自噬水平后,CEP63蛋白的表达亦呈现出与自噬水平相反的变化,说明CEP63蛋白表达是受到细胞自噬调节的。结合前述部分的结果,我们不难得出,CCDC67基因是通过PI3K/AKT/mTOR信号通路调控细胞自噬,进而降解CEP63蛋白以减少其在细胞内的累积的。这也就说明,在甲状腺乳头状癌中,两个中心体复制的途径DD途径对MCD是存在抑制效应的,而这种抑制效应丢失和MCD复制途径的主导,很可能是甲状腺乳头状癌发生的关键环节。