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目的:通过研究细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal regulated kinase1/2,ERK1/2)信号通路的特异性阻断剂PD98059对小鼠淋巴细胞的活化、增殖和细胞周期的影响,同时研究PD98059对Jurkat T细胞的增殖、细胞周期以及ERK1/2、磷酸化的ERK1/2(phosphorylation-ERK1/2,P-ERK1/2)、细胞周期标志蛋白--反向CCAAT盒结合蛋白(inverted CCAAT box binding protein of 90 kD,ICBP90)的影响,从而探讨ERK1/2信号通路在Jurkat T细胞增殖调控中的作用。方法:无菌分离小鼠淋巴结细胞,不同浓度PD98059处理,加入多克隆刺激剂刀豆蛋白(concanavalin,ConA)刺激,CD69-FITC、CD25-FITC、CD3-PE荧光标记单克隆抗体染色,流式细胞术分析PD98059对淋巴细胞表面活化标志CD69、CD25的影响。藉羧基荧光素乙酰乙酸(carboxy fluorescein diacetate,succinimidyl ester,CFDA-SE)染色,不同浓度PD98059处理细胞,加入ConA刺激,流式细胞术分析PD98059对淋巴细胞增殖的影响;选取最佳浓度PD98059处理细胞,加入ConA刺激,流式细胞术分析不同时间PD98059对淋巴细胞增殖的影响;不同浓度PD98059处理细胞,加入ConA或二丁基佛波醇酯(phorbol 12, 13-dibutyrat, PDB)加离子霉素(ionomycin,Ion)刺激,碘化丙锭(propidiumiodide,PI)染色并结合流式细胞术分析PD98059对小鼠淋巴细胞细胞周期的影响。同时采用CFDA-SE染色和MTT法检测不同浓度PD98059对Jurkat T细胞增殖的影响,PI染色并结合流式细胞术分析PD98059对Jurkat T细胞细胞周期变化的影响。然后利用不同浓度、不同信号通路特异性阻断剂LY294002、AG490、GF109203X、Genistein以及LY294002联合AG490处理Jurkat T细胞,观察它们对Jurkat T细胞增殖的影响。进而分别选取最佳浓度的PD98059(30μmol/L)、LY294002(30μmol/L)、AG490(30μmol/L)、LY294002(15μmol/L)+AG490(15μmol/L)、GF109203X(5μmol/L)和Genistein(30μmol/L),通过Western Blot检测这些特异性阻断剂于不同时间对Jurkat T细胞中ERK1/2、P-ERK1/2和ICBP90蛋白表达的影响。分析ERK1/2信号通路在调控Jurkat T细胞增殖中的作用及其与其它信号通路之间的关系。结果:荧光标记单克隆抗体染色显示,不同浓度PD98059仅能轻度抑制淋巴细胞表面活化标志CD69的表达,而对CD25的表达没有影响。CFDA-SE染色分析显示,不同浓度PD98059对ConA刺激淋巴细胞的增殖具有明显的抑制作用,且呈剂量依赖关系(r=0.985,P<0.01)。选取最佳浓度为30μmol/L的PD98059观察不同时间其对淋巴细胞增殖的影响,结果发现随着时间的延长,PD98059对淋巴细胞的增殖抑制作用逐渐升高(r=0.973,P<0.01),且抑制率随时间也明显升高。细胞周期分析表明,PD98059可阻止ConA刺激的淋巴细胞进入S期和G2/M期,但亚二倍体峰变化并不明显;PD98059对PDB+Ion刺激淋巴细胞细胞周期的影响与ConA相似,不同的是S期和G2/M期的变化较ConA作用更为明显。MTT法检测显示PD98059对Jurkat T细胞的增殖具有显著的抑制作用,且呈剂量依赖关系(r=0.960,P<0.05)。细胞周期分析表明,PD98059可使Jurkat T细胞停滞于G0/G1期。MTT法检测显示不同浓度各种阻断剂对Jurkat T细胞的增殖具有明显的抑制作用,且呈剂量依赖关系。其中LY294002(r=0.977,P<0.01)、AG490(r=0.950,P<0.01)、GF109203X(r=0.980,P<0.05)、Genistein(r=0.982,P<0.05)。Western Blot检测显示,PD98059作用3h可部分下调ERK1/2的表达,而其它阻断剂对ERK1/2的表达均无影响;各阻断剂作用24 h对ERK1/2的表达均无影响。PD98059、LY294002作用3 h可明显下调P-ERK1/2的表达,LY294002+AG490、AG490、GF109203X、Genistein也可使P-ERK1/2的表达下调,作用24 h的情况与3 h时类似,只是程度减弱。各阻断剂作用3 h时均能部分上调Jurkat T细胞中ICBP90蛋白的表达,并以PD98059表现最为明显;而在24 h这种上调作用表现更为明显。结论:PD98059仅能轻度抑制小鼠淋巴细胞的早期活化,却能显著抑制原代淋巴细胞和Jurkat T细胞的增殖,且呈剂量依赖关系。这种对淋巴细胞增殖的抑制作用与其使细胞停滞于G1/G0期,阻止细胞进入S期和G2/M期有关,ERK1/2信号通路的的活化是调控Jurkat T细胞增殖的重要途径,PI-3K、PKC、JAK/STAT、TPK信号通路可能与ERK1/2信号通路上游关联。ERK1/2信号通路的阻断导致Jurkat T细胞增殖的抑制可能不是直接通过ICBP90所介导。