【摘 要】
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目的:寻找差异表达的泛素结合酶E2,筛选出其相关的E3泛素连接酶,研究该E3泛素连接酶在肺腺癌中的表达水平及其临床意义,并验证该泛素连接酶E3在肺腺癌中的作用。方法:1、通过ONCOMINE、UALCAN、HPA、The Kaplan-Meier plotter[lung]、cBioPortal和GEPIA等多个数据库,筛选出有差异表达的E2泛素结合酶,并验证该E2泛素结合酶的临床意义。通过该E2
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目的:寻找差异表达的泛素结合酶E2,筛选出其相关的E3泛素连接酶,研究该E3泛素连接酶在肺腺癌中的表达水平及其临床意义,并验证该泛素连接酶E3在肺腺癌中的作用。方法:1、通过ONCOMINE、UALCAN、HPA、The Kaplan-Meier plotter[lung]、cBioPortal和GEPIA等多个数据库,筛选出有差异表达的E2泛素结合酶,并验证该E2泛素结合酶的临床意义。通过该E2泛素结合酶在多个不同的研究中寻找与其共同变化的相邻基因,以此确定下一步需要研究的E3泛素连接酶。2、从公共数据库及我科临床标本两个方面验证该E3泛素连接酶的临床意义及预测其功能。3、检测野生型肺腺癌细胞系中该E3泛素连接酶的表达情况,挑选其中一个细胞系通过慢病毒感染,构建该E3泛素连接酶过表达稳转细胞系及CRISPR/Cas9敲除细胞系。4、通过CCK-8实验、Transwell实验和细胞划痕试验检测该E3泛素连接酶对肺腺癌增殖、侵袭和迁移能力的影响。结果:1、肺腺癌中UBE2C、UBE2S相比于正常肺组织mRNA及蛋白表达增高,且与患者临床分期相关。肺腺癌患者中UBE2C和UBE2S mRNA水平升高预示着患者有更差的总生存期和无进展生存期。肺腺癌中随着UBE2C和UBE2S最常改变的相邻基因为 HECTD3。2、肺腺癌组织中HECTD3的mRNA、蛋白表达均明显高于正常对照组,且有随着分期的升高,HECTD3表达量有增高的趋势。肺腺癌患者中HECTD3 mRNA高表达预示患者有更差的总生存期（HR=1.65,95%CI:1.31-2.09）和无进展生存期（HR=1.68,95%CI:1.23-2.31）。对临床标本进行转录组测序,结果显示肺腺癌组织中HECTD3的表达量高于癌旁正常组织,与肺腺癌组织学亚型、高危因素（累及血管和/或胸膜/气腔内播散/瘤栓）及是否有淋巴结转移均有关。3、GO分析的结果推测HECTD3与基因表达、蛋白代谢、酶绑定、蛋白复合体绑定、泛素蛋白连接酶绑定密切相关。KEGG分析显示HECTD3与肿瘤信号通路、p53信号通路、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、甲状腺癌和凋亡相关。4、在纳入筛选的细胞系中野生型A549细胞HECTD3蛋白表达最高。构建的HECTD3过表达稳转细胞系在mRNA和蛋白水平HECTD3均表达上调。构建的CRISPR/Cas9敲除稳转细胞系HECTD3基因exonl第282个核苷酸位点出现了插入突变导致HECTD3被完全敲除。5、CCK-8实验结果显示令野生型A549细胞增殖率为100%,则HECTD3敲除组为47.6%,HECTD3过表达组为125.8%。Transwell结果显示相比于野生型A549细胞,HECTD3敲除组每个视野下的细胞数显著减少,HECTD3过表达组每个视野下的细胞数显著增多。细胞划痕实验结果显示HECTD3过表达组细胞划痕间伤口愈合距离百分比明显高于野生型A549细胞。HECTD3敲除组细胞划痕间伤口愈合距离百分比明显低于野生型A549细胞。结论:1、UBE2C和UBE2S在肺腺癌中的表达较正常组均明显上调。UBE2C和UBE2S的表达与HECTD3的表达成正相关。2、HECTD3在肺腺癌组织中表达水平较癌旁正常组织明显上调且与肺腺癌患者的N分期、影响预后的高危因素、病理学亚型相关。3、成功构建HECTD3过表达稳定转染A549细胞系和HECTD3敲除稳定转染A549细胞系。4、HECTD3促进体外肺腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移。
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