黑老虎果实提取物抗腹泻作用机制及化合物分离与含量测定

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黑老虎(Kadsura coccinea(Lem.)A.C.Smith)为五味子科(Schisandraceae)南五味子属藤蔓植物,其根茎为民间用药,主要用于治疗胃溃疡、十二指肠溃疡、急性肠胃炎、痛经、跌扑扭伤、风湿骨痛等。课题组在民间考察发现黑老虎果皮可以快速缓解急性腹泻,但缺乏现代科学研究。本研究以黑老虎果实提取物为原料,采用小鼠模型研究其抗腹泻、抗炎效果,通过16s核糖体RNA(r RNA)基因扩增子高通量焦磷酸测序分析肠道菌群,然后对其中主要化合物进行分离、结构鉴定,最后进行含量测定。主要研究结果如下:(1)采用紫外分光光度法对黑老虎果实提取物中木脂素、三萜及黄酮含量进行测定,然后对SPF小鼠进行细菌性腹泻、药物性腹泻和小肠炭末推进实验。结果表明,黑老虎全果提取物中木脂素类、三萜类及黄酮类化合物的含量分别为44.48%、4.57%、14.02%;黑老虎果实提取物各剂量组对细菌性腹泻小鼠均有较好的预防效果,其中高剂量组(200 mg/kg)最佳,与模型组呈极显著差异(P<0.01),效果亦优于阳性药物组;提取物各剂量组均能减少番泻叶腹泻小鼠稀便数量,且与模型组呈显著差异,但对潜伏时间没影响;提取物对小鼠小肠碳末推进无明显影响。(2)采用大肠埃希氏菌(EIEC)对小鼠进行腹泻和肠道炎症造模,研究黑老虎果实提取物水溶性组分(200 mg/kg)、脂溶性组分(2.0 mg/kg、6.0 mg/kg)及全果组分(200mg/kg)的抗腹泻与抗炎效果。结果显示三种组分均未对小鼠体重、肠道长度有显著性影响;水溶性提取物组较模型组小鼠腹泻指数显著降低,肠道损伤程度有明显改善;脂溶性提取组在低剂量(2.0 mg/kg)时较模型组小鼠腹泻指数降低、肠道炎症严重程度降低、肠道损伤程度有明显改善,高剂量(6.0 mg/kg)时较模型组小鼠腹泻指数极其显著降低、炎症程度显著降低、肠道未见明显损伤;全果提取物组较模型组小鼠腹泻指数极其显著降低、炎症程度显著降低、肠道未见明显损伤。表明黑老虎果实各组分均能抵抗EIEC引起的腹泻、炎症和肠道损伤。(3)对试验小鼠的粪便进行16S分析,研究黑老虎果实提取物各组分对小鼠肠道菌群的影响。结果显示各组分能显著性改变68种小鼠肠道菌群的丰富度和均匀度,其中3种是研究报导对肠道功能影响较大的菌群,即乳酸杆菌、拟杆菌和毛螺菌,但不同的黑老虎果实提取物组分对肠道菌的组成结构改变效果是不一样的:全果提取物组、脂溶性提取物高剂量组(6.0 mg/kg)均能显著增加小鼠肠道中乳酸杆菌(Lactobacilli)的菌群丰度,全果提取物组能从纲水平(Gammaproteobacteria)到属水平(Burkholderiaceae)显著增加乳酸杆菌(Lactobacilli)的菌群丰度;水溶性提取物组能显著增加拟杆菌(Bacteroidaceae)的菌群丰度;水溶性提取物组、脂溶性提取物高剂量组(6mg/kg)均能显著减少毛螺菌科(Lachnospiraceae)的菌群丰度。(4)采用高速逆流色谱和制备型高效液相色谱联用技术对脂溶性进行制备分离,得到5个化合物。通过核磁鉴定化合物1鉴定为6-epi-gomisin、化合物2鉴定为Deacetykadsurin、化合物3鉴定为Propinquanin F、化合物4鉴定为南五味子素、化合物5未能鉴定。(5)利用所制得的化合物为对照品,对其中含量最高的4个化合物对进行含量测定。结果显示脂溶性组分中化合物2含1.188%,化合物3含1.195%,化合物4含1.086%,化合物5含1.058%;全果提取物中化合物2含0.396%,化合物3含0.401%,化合物4含0.368%,化合物5含0.327%。
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