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目的： 本课题首先对前列腺癌PC-3细胞小规模体外二维到三维静止培养条件的逐步优化，后在wave20/50生物反应器中利用2L-cell-bag和微载体cytodex3对PC-3细胞动态培养过程中的摆动方式和营养条件的进一步优化，从而建立了一个适合PC-3细胞在波浪式生物反应器中大规模培养的新型平台，为今后的动物实验和肿瘤细胞疫苗的产业化发展奠定了基础。 方法： 1.PC-3细胞二维静止培养的条件优化: 在二维培养皿中利用24孔板对PC-3细胞的基本生长特性，种子细胞培养基进行优化，从文献查阅常用的四种培养基中选出PC-3细胞生长形态最好，达到对数期时间最短，生长密度最高的培养基，用倒置显微镜观察细胞的生长形态，用血球计数板绘制细胞的生长曲线。 2.PC-3细胞三维静态培养的条件优化: 在10cm细菌培养皿中对微载体的初始接种密度，细胞的初始接神密度，微载体的类型cytodex1和cytodex3，血清浓度，培养基，扩大培养方式，新旧球的加入比例等条件的优化，使用细胞动力学分析细胞生长活力，通过倒置显微镜观察细胞在微载体上的贴壁和生长状态，用0.1％结晶紫柠檬酸染液对细胞核染色并绘制生长曲线，用葡萄糖和乳酸试剂盒，对细胞的营养代谢情况在酶标仪进行监测。 3.PC-3细胞三维动态培养的条件优化: 在wave20/50生物反应器中利用2L-cell-bag，设定5％CO237℃，0.01通气流速的情况下，对PC-3细胞在小规模三维静止的条件基础上分别采取全摆动，不摆动，间隙摆动的培养方式在wave20/50生物反应器中培养，考察了培养基中不同起始血清浓度对PC-3细胞贴壁和生长的影响;营养物质（葡萄糖）的补充对PC-3细胞生长的影响;通过绘制生长曲线和观察细胞生长状态，监测葡萄糖和乳酸代谢情况，收获细胞数等参数进行最适培养条件的优化。 采用流式细胞分析仪对微载体培养的PC-3细胞膜表面生物素化和hGM-CSF蛋白的修饰功能进行鉴定。 结果： 1.在二维静止培养方式中，使用了四种含10％FBS的培养基分别培养PC-3细胞，其中选取含10％FBS的RPMI1640培养基作为种子细胞培养基，其PC-3细胞的分泌颗粒物最少，细胞形态呈饱满梭形，细胞内空泡较少，细胞老化速度慢，最大细胞密度达到1.26x106cell/ml，固选为种子培养基对其进行扩大培养。 2.在3D静止培养体系，我们选择以3g/l cytodex3和2x105cell/ml细胞密度的接种条件，比较了不同起始血清浓度(10％，5％，2％，0％FBS)对PC-3细胞生长状况的影响，血清浓度和细胞的最大密度成正相关;随后比较了双相血清浓度培养方法，其中起始血清浓度为10％ RPMI1640待细胞贴壁后将血清浓度降至5％与全程使用10％FBS培养的生长曲线基本相似，相对于全程使用5％FBS的培养基细胞密度分别提高了1.7和1.64倍。 3.PC-3细胞在cytodex3静止的培养条件下，在10cm2细菌培养皿中对其贴满载体的细胞进行不消化直接接种新旧球比例为1∶1-2∶1时，细胞可以通过“侨联”的作用贴满新球，在模拟细胞循环培养体系中对培养基进行每天半量换液的操作，建立了一种小规模模拟球转球传代的培养方式，为后期PC-3细胞的大规模扩大培养奠定了基础。 4.在3D动态培养方式中，使用微载体3g/l cytodex3和2x105cell/ml细胞密度的接种条件下，利用wave20/50生物反应器在2L细胞培养袋500ml的培养体积中，结合气体和温度易于控制，在波浪式生物反应器中采取静止——间隔——连续摆动的培养方式（待细胞在微载体贴壁后逐步提高转动时间，摆动角度为5°6-9rpm范围内，利于营养物质和氧气传递率的扩散），最终收获细胞为5.3x108cells，相对于静止培养和连续培养分别提高了1.42和2.54倍，建立了一种适合wave20/50生物反应器动态培养PC-3细胞的平台。 5.在wave20/50生物反应器微载体1L培养体系中，在每天50％换的培养基中补充1g/l的葡萄糖，血清浓度降到2％的条件下，相对于不添加葡萄糖的培养基，细胞在微载体上的贴壁时间更久，细胞在微载体上伸展的形态更好，细胞最大密度1.23x106cell/ml，与对照组相比高1.24倍，最终细胞收获数为8.53x108cells，相比对照组，提高了1.18倍。 6.流式细胞分析仪检测二维培养和三维培养的PC-3细胞的膜表面蛋白修饰效率均达95％以上，说明此微载体培养PC-3细胞的平台可以用于前列腺癌疫苗的大规模制备。 结论： 本课题是利用微载体培养技术，建立了一种适合PC-3细胞在wave20/50生物反应器中大规模培养平台，并经过多次实验对PC-3细胞三维培养条件进行优化，创建了双相血清浓度和间隔摆动的培养方式，在2L细胞培养袋中培养PC-3的最终细胞数约达109cells的产量，为动物实验高密度肿瘤疫苗的需求和后期临床实验研究奠定了基础。 本课题的成功实施将使细胞膜表面修饰的肿瘤细胞疫苗的研制水平更进一步，并有助于其它常见肿瘤（如非小细胞肺癌、肝癌、胃癌、肠癌和急性白血病等）治疗性疫苗的开发，最终形成有自主知识产权的肿瘤疫苗产业群，具有巨大的潜在社会和经济效应。