目的:利用ApoE3、ApoE4转基因小鼠制作原代神经元以建立阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)模型。分别检测神经元中沉默信息调节因子3(Sirtuin3,Sirt3)的表达量,以及ApoE4对线粒体功能的影响。评估Sirt3改变对ApoE3、ApoE4原代神经元线粒体功能、细胞代谢的影响。方法:1.使用出生后24小时内携带人ApoE3、ApoE4基因的转基因小鼠,体外剥去脑膜、血管,分离大脑皮层,胰酶消化后种于含neurobasal A、B27、L-谷氨酰胺、链霉素和青霉素的培养基中,置于含5%CO2的37℃培养箱中,进行细胞培养。2.将外源小鼠Sirt3 cDNA序列亚克隆到Lenti-CMV-GFP载体中以过表达Sirt3。构建靶向Sirt3 764位点的19个核苷酸的短序列,将其克隆至Omics Link小发夹RNA(sh RNA)载体,以敲低Sirt3的表达,将sh RNA载体、lenti-SIRT3载体和对照载体包装到慢病毒转染系统。细胞培养至7天时,慢病毒侵染ApoE3、ApoE4神经元,并应用嘌呤霉素进行筛选,成功转染的细胞表达绿色荧光。3.Western blot检测ApoE3、ApoE4神经元中Sirt3的表达水平。4.Mitoxpress X tra-氧消耗法和发光ATP检测试剂盒评估ApoE3、ApoE3+Sirt3 sh RNA、ApoE3+Sirt3 cDNA、ApoE4、ApoE+Sirt3 sh RNA和ApoE4+Sirt3 cDNA神经元耗氧量和ATP水平。5.实验数据均采用平均数±标准差(mean±SEM)表示,多组间比较用ANOVA检验,用Graph Pad Prism统计分析软件处理数据。当P值小于0.05时认为有统计学意义。结果:1.与ApoE3小鼠神经元相比,ApoE4小鼠神经元Sirt3表达水平下降。2.氧消耗动力学显示ApoE4神经元氧耗率振幅降低、产生ATP明显低于ApoE3,ApoE4神经元氧耗率斜率升高。3.与ApoE4神经元相比,ApoE4+Sirt3 cDNA神经元氧耗率振幅升高、产生ATP增多,氧耗率斜率降低。ApoE4+Sirt3 sh RNA神经元氧耗率振幅降低、ATP产生减少,氧耗率斜率升高。与ApoE3神经元相比,ApoE3+Sirt3 sh RNA神经元氧耗率振幅降低、ATP产生减少,而氧耗率斜率没有明显变化。结论:1.ApoE4转基因神经元的Sirt3表达量下降,线粒体功能受损。2.Sirt3介导了ApoE4神经元中线粒体功能的损伤。