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目的: 1.用乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)基因组基本启动子(Basic Core Promoter,BCP)内的基因片段替换土拨鼠肝炎病毒(Woodchuck Hepatitis virus,WHV)基因组的同源序列,改造WHV基因组。 2.筛选出在体内和体外实验中复制能力更强的WHV复制质粒,为WHV的研究提供更方便的操作对象,为最终解决慢性乙肝的致病机制、免疫治疗策略等科学问题提供更好的动物模型。 方法: 1.用HBV基因组中BCP区内的基因片段替换WHV基因组中的相应基因片段来构建具有复制能力的WHV质粒。 2.WHV复制质粒转染细胞,realtime PCR检测细胞内病毒核心DNA水平,Southern Blot检测细胞内病毒复制中间体的水平。 3.小鼠体内高压尾静脉注射WHV复制质粒,real-time PCR检测小鼠血清中病毒核心DNA水平,免疫组化检测病毒抗原表达。 结果: 1.测序结果显示,成功构建了4种WHV复制质粒M1、M2、M3、M4。 2.M1、M2、M3、M4转染Huh7细胞和HepG2细胞,细胞内WHV核心DNA水平高于野生型WHV质粒;细胞内WHV复制中间体水平高于野生型WHV质粒。 3.M1、M2、M3、M4高压尾静脉注射ICR雄性小鼠,第7天和第14天M1和M2注射小鼠的血清病毒核心DNA水平明显高于野生型WHV质粒;第14天M1、M2、M3、M4注射小鼠肝脏内WHcAg表达高于野生型WHV质粒。 4.M1、M2、M3、M4高压尾静脉注射BALB/c雄性小鼠,第7天和第14天M1和M2注射小鼠血清病毒核心DNA水平明显高于野生型WHV质粒;第14天M1、M2、M3、M4注射小鼠肝脏内WHcAg表达高于野生型WHV质粒。 结论: 经过改造的WHV复制质粒M1、M2在体外、体内实验中表现出更强的复制能力。