研究背景和目的:耐顺铂人上皮性卵巢癌和晚期卵巢癌的治疗已成为目前临床医师治疗上棘手问题,寻找安全有效的抗耐顺铂化疗药物的卵巢癌中药意义重大。我们前期工作发现雷公藤内酯醇(TP)对耐顺铂药物的人上皮性卵巢癌有抑制作用,并研究了其相关抑制机制。肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)可诱导恶性肿瘤的生长,TAMs的极化在恶性肿瘤的发生、发展中起重要作用,而PI3K/Akt/NF-κB信号通路在TAMs极化扮演着重要的角色。我们前期工作也发现,TP可阻断PI3K/AKT信号通路进而抑制耐顺铂人上皮性卵巢癌生长。据此提出假设:TP可通过抑制PI3K/AKT/NF-κB信号通路促进TAMs向M1型巨噬细胞极化,抑制其向M2型巨噬细胞极化,从而促进卵巢癌细胞凋亡。因此,本实验从分子水平、细胞水平、组织以及动物水平等多层次探讨了TP作用于耐药上皮性卵巢癌后TAMs极化情况及PI3K/AKT/NF-κB信号通路相关蛋白的变化,从而验证了TP通过对PI3K/AKT/NF-κB信号通路调节及调控肿瘤微环境进而发挥抗肿瘤作用。这个新视点为TP为耐顺铂化疗药物的上皮性卵巢癌和晚期卵巢癌患者的治疗提供实验依据和理论基础。方法:1、体外实验1.1 TAMs体外模型的建立1.1.1佛波酯(PMA)诱导THP-1细胞分化:取细胞生长状态良好的THP-1细胞株,调整细胞密度为6*10~5个/ml,细胞接种于6孔板中,加入不同浓度的PMA,PMA浓度依次为0、100、200ng/ml,最后补充含1%谷氨酰胺、10%胎牛血清、1%双抗(青霉素和链霉素)配制的1640培养基至2ml,以0ng/ml PMA孔作为阴性对照孔,分别培养24h和48h后观察各孔细胞贴壁情况及细胞形态变化,以确定PMA诱导THP-1细胞分化的优化浓度和作用时间。1.1.2建立稳定的M1型及M2型巨噬细胞:THP-1细胞经过100ng/ml PMA诱导24h后,待细胞贴壁生长状态良好后,分别采用100μg/ml IL-4和10ng/ml LPS刺激被PMA诱导后的THP-1细胞株(可分别得到M2型TAMs和M1型TAMs),细胞分别放入细胞培养箱内培养48h,观察细胞生长状态。48小时后离心分别收集各组细胞上清液,采用ELISA法检测细胞上清液IL-10和IL-12的OD值,对体外模型巨噬细胞的诱导进行鉴定。1.2 CCK-8法检测雷公藤内酯醇对A2780/DDP细胞增殖的影响取对数生长期的A2780/DDP细胞株作为研究对象,给予不同浓度TP进行干预。实验分组分别为(0ng/ml、6.25ng/ml、12.5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)TP,分别作用A2780/DDP细胞株24h之后用CCK-8方法检测每孔光吸收值(即OD值),计算TP对A2780/DDP细胞作用24h后的IC50值。1.3观察雷公藤内酯醇对A2780/DDP细胞增殖、侵袭转移能力的影响1.3.1 EDU检测TP对A2780/DDP细胞增殖影响:根据EDU试剂盒操作方法,将细胞分组为:(1)空白组:只加培养基(2)6.25ng/ml TP组(3)12.5ng/ml TP组(4)25ng/ml TP组(5)50ng/ml TP组(6)共培养组:细胞加已诱导的M2巨噬细胞上清液。1.3.2分别采用细胞划痕试验、细胞外基质粘附试验及Transwell试验检测不同浓度TP对A2780/DDP细胞干预后细胞的侵袭转移能力:分组同上。不同浓度的TP作用于肿瘤细胞后,用以上三种不同实验方法,观察TP作用细胞前、后,细胞的侵袭转移能力的变化。2、体内实验2.1、建立皮下移植瘤模型取对数生长期A2780/DDP细胞,将细胞密度调整为2*10~7个/ml。接种于裸鼠皮下,观察肿瘤变化,待肿瘤大小约100mm~3左右时进行实验。裸鼠随机分为五组:阴性对照组、空白对照组、DDP组、TP组、联合(DDP+TP)组,每组6只裸鼠进行实验。2.1.1各组给药方法:(1)阴性对照组:生理盐水按50 ml/kg/d,腹腔注射给药,一次/天,连续用药14天。(2)空白对照组:生理盐水按50 ml/kg/d,腹腔注射给药,一次/天,连续用药14天。(3)DDP组:DDP按4 mg/kg/d,腹腔注射给药,第1天和第8天给药,总共用药2天。(4)TP组:0.15 mg/kg/d雷公藤内酯醇生理盐水稀释成终体积0.2 ml,予以腹腔注射给药,一次/天,连续用药14天。(5)联合(DDP+TP)组:TP按0.15mg/kg/d,腹腔注射给药,一次/天,连续用药14天,DDP按4 mg/kg/d腹腔注射给药,第1天和第8天给药,总共用药2天。给药24h后收集外周血及移植瘤体标本备用。2.2 ELISA法检测裸鼠外周血血清中IL-12和IL-10的OD值水平:将各组裸鼠外周血离心后,留取血清上清液,按ELISA试剂盒说明操作,检测各组外周血血清IL-12和IL-10的OD值水平。2.3测量各组裸鼠移植瘤重量及体积:处死裸鼠后,完整剥离移植瘤体,称取肿瘤湿重。测量肿瘤最长径(a)和最短径(b),V=ab~2/2。2.4采用TUNEL法检测TP实验组裸鼠皮下移植瘤细胞凋亡,以及采用免疫组化检测各实验组移植瘤组织中CD16/32和CD206蛋白表达。2.5采用Western-blot分析各组P13K/AKT/NF-κB信号通路中相关蛋白因子AKT、P-AKT、P65、P-P65的表达变化以及MMP-2、MMP-9及VEGF蛋白的变化,通过Image J图像分析软件计算各种蛋白在不同组图片中的平均光密度值。结果:1、体外实验1.1、TAMs体外模型的建立1.1.1采用100ng/ml PMA诱导THP-1细胞株24h后,光学显微镜下可见THP-1细胞由单个圆形悬浮细胞逐渐变为贴壁细胞,细胞形态不规则,并伸出伪足明显,细胞浆透明,细胞光镜下折光度良好,贴壁细胞数量明显增加,此时细胞生长状态最佳。故选择100ng/ml PMA诱导THP-1细胞24h作为巨噬细胞的诱导剂量及作用时间。1.1.2 ELISA法检测细胞经不同因子刺激后,细胞刺激前、后M2型巨噬细胞表型IL-10 OD值分别为(0.203±0.059)和(0.610±0.048)(两者之间P<0.05),细胞刺激前、后M1型巨噬细胞表型IL-12 OD值分别为(0.203±0.068)和(0.613±0.057)(两者之间P<0.05)。说明对体外模型巨噬细胞的诱导是可行的。1.2、不同浓度TP对A2780/DDP细胞增殖的影响:TP对A2780/DDP细胞24小时有抑制作用,6.25ng/ml TP对细胞的抑制率为:(6.63±1.21)%,12.5ng/ml TP对细胞的抑制率为:(39.43±2.46)%,25ng/ml TP对细胞的抑制率为:(70.91±2.59)%。50和100ng/ml TP对细胞的抑制率均为100%,而共培养组中细胞存活率为124.24%。故TP作用A2780/DDP细胞24h后的IC50为12.5ng/ml。1.3、TP对A2780/DDP细胞增殖、侵袭转移能力的影响:1.3.1 EDU结果提示:共培养组见大量染成红色细胞,与阴性对照组相比,染成红色细胞数量明显增多。而TP组染成红色细胞数量少于共培养组,随着TP浓度的增加,新增殖细胞数量随之减少,说明细胞经TP干预后,渗入细胞DNA复制期间的EDU少,新增殖的细胞少,反映细胞增殖差,进入S期的细胞百分数少。1.3.2 M2巨噬细胞与A2780/DDP细胞共培养24h后,发现细胞之间距离缩短,细胞形态改变,细胞形态被拉长变为长梭形。M2巨噬细胞与A2780/DDP细胞共培养可促进肿瘤细胞生长活跃。细胞划痕实验显示,与M2巨噬细胞共培养后的肿瘤细胞爬片能力明显增强,TP组细胞爬片能力弱于共培养组,表现在划痕区域细胞少于共培养组,并随TP浓度的增加,划痕区域的细胞更少。同样,细胞粘附实验和Transwell实验证实A2780/DDP细胞与M2巨噬细胞共培养后,具有更多肿瘤细胞出现粘附和穿过小室。TP作用细胞后,细胞发生粘附和穿过小室的肿瘤数目减少,并且随TP浓度的增加,细胞发生粘附和穿过小室的肿瘤数目更少。表明A2780/DDP细胞与M2巨噬细胞共培养后肿瘤细胞的迁移及侵袭能力增强,TP作用于肿瘤细胞后,肿瘤细胞发生侵袭转移能力下降。2、体内实验2.1裸鼠成瘤后,各组肿瘤体积及重量不同,各组瘤体积:对照组(466.463±52.493)mm3,DDP组(309.843±52.595)mm~3,TP组(223.870±22.585)mm3,联合组(149.460±33.670)mm3。DDP组、TP组及联合组瘤体积均明显小于对照组(P<0.05)。TP组和DDP组瘤体积均大于联合组(P<0.05)。各组瘤重:对照组(0.851±0.126)g,DDP组(0.541±0.055)g,TP组(0.394±0.034)g,联合组(0.244±0.047)g。TP组、DDP组及联合(DDP+TP)组瘤重均明显小于对照组(P<0.05),TP组和DDP组瘤重,均大于联合(DDP+TP)组(P<0.05)。2.2检测裸鼠外周血血清中IL-12和IL-10的OD值水平:(1)血清IL-10的检测情况:空白对照组(104.50±5.91)pg/ml,阴性对照组(39.84±4.12)pg/ml,DDP组(66.89±12.33)pg/ml,TP组(63.15±11.82)pg/ml,联合(DDP+TP)组:(34.05±7.60)pg/ml。阴性对照组、DDP组、TP组及联合(DDP+TP)组血清IL-10均小于空白对照组(P<0.05)。DDP组和TP组血清IL-10均高于联合(DDP+TP)组(P<0.05)。(2)血清IL-12的检测情况:空白对照组(37.16±4.23)pg/ml,阴性对照组(167.59±8.04)pg/ml,DDP组(80.81±6.82)pg/ml,TP组(79.17±6.05)pg/ml,联合(DDP+TP)组:(139.48±6.13)pg/ml。阴性对照组、DDP组、TP组及联合(DDP+TP)组血清IL-12均大于空白对照组(P<0.05)。DDP组和TP组血清IL-12均低于联合(DDP+TP)组(P<0.05)。2.3肿瘤组织HE染色可见肿瘤细胞存在异型性,细胞核被染成蓝紫色,细胞质被染成红色,核浆比增高,巨核或多核等改变。TUNEL显示:空白对照组(8.83±0.75)个/镜下,TP组(18.83±1.17)个/镜下,两者相比较,TP组的细胞凋亡明显升高(P<0.01)。2.4免疫组化检测各实验组作用成瘤裸鼠后肿瘤组织中CD16/32和CD206蛋白表达:与空白对照组相比,DDP组、TP组及联合组中CD16/32蛋白高于空白对照组,可见细胞浆染至棕黄色,尤其是联合组中,CD16/32蛋白呈强阳性表达。而空白对照组部分细胞浆染呈淡黄色,CD16/32蛋白呈弱阳性表达。与空白对照组相比,DDP组、TP组及联合组中CD206蛋白表达低于空白对照组,可见部分细胞浆染至淡黄色,尤其是联合组中,CD206蛋白呈弱阳性表达。而空白对照组细胞浆染呈深黄色,CD206蛋白呈强阳性表达。2.5、Western-blot分析各组蛋白的表达:Western-blot结果提示,通过图片灰度值比较,与空白对照组相比,DDP组、TP组及联合组中VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白低于空白对照组(P<0.05),而联合组蛋白表达最低。各组非p-p65和非p-AKT蛋白无差异(P>0.05)。而各组p-p65和p-AKT蛋白表达均低于空白对照组(P<0.05),联合组p-p65和p-AKT蛋白表达水平最低。结论:1、体外诱导TAMs可行。2、TP可抑制A2780/DDP细胞生长,促进细胞凋亡,呈时间-剂量依赖关系。3、TP可协同DDP诱导人耐顺铂卵巢癌A2780/DDP细胞凋亡,增加A2780/DDP对顺铂的敏感性。4、TP诱导肿瘤细胞凋亡机制可能与抑制了PI3K/AKT/NF-κB生存信号通路,下调磷酸化AKT和磷酸化NF-κB表达,抑制MMP-2、MMP-9及VEGF蛋白表达,从而抑制TAMs向M2型巨噬细胞极化,促进TAMs向M1型巨噬细胞极化,促进肿瘤细胞凋亡。