组织工程皮肤可作为自体、异体皮肤移植物的有效替代物用于治疗大面积皮肤烧伤以及各类顽固性皮肤疾病，也可作为组织模型用于皮肤病理和药理的研究，因而组织工程皮肤具有巨大的市场需求。 然而目前组织工程真皮的体外构建主要采用静态的接种和培养方式，存在着培养周期长、细胞分布不均匀、产品质量不稳定、生产成本高等问题，严重限制了组织工程皮肤的广泛应用，其根源在于(1)对细胞接种过程缺乏必要的研究，使得细胞在支架材料内的起始密度、分布无法控制，导致构建的真皮组织形态和功能存在显著差异；(2)未能解决组织培养过程中的传质限制，无法满足细胞生长和组织发育对营养物的需求，对三维支架中细胞生长代谢、基质表达沉积、组织发育与培养环境之间的关系缺乏认识。为此本文从工程学的角度出发，对工程化真皮组织体外构建过程中的两大关键技术即细胞接种和组织培养技术进行了研究。 通过比较和分析三种接种方式(静态接种、转瓶接种和灌注接种)，结果表明灌注接种能得到较高的接种率，细胞在支架材料内分布均匀，且无细胞损伤发生。而转瓶接种的细胞却在支架表面形成了致密的细胞层，内部细胞稀少，静态接种时细胞不仅只分布于支架材料的表面，而且有明显的细胞团。 研究结果表明，由灌注接种得到的起始细胞均匀分布的复合物对真皮组织的体外构建有积极意义，每个细胞在材料内可有足够的空间铺展和生长，可以延长细胞在支架内的增殖期，提高组织的细胞密度，同时均匀的起始细胞分布还有助于得到形态均一、细胞分布均匀的真皮替代物，而细胞和ECM的均匀分布可以有效减少工程组织在构建过程中的收缩。在起始细胞分布均匀的前提下，较高的起始细胞密度可以缩短组织构建所需的时间，而且在一定范围(5.64×105cells/cm2～15.3×105cells/cm2)内，起始细胞密度对组织中的细胞生长代谢、构建组织最终达到的细胞密度以及组织收缩等均没有显著影响。 采用三种粘附特性具有显著差异的细胞进一步研究了影响灌注接种效率的主要因素及其作用机制，首次通过实验证明了物理截留和配体-受体特异性结合是灌注接种过程中细胞被捕获的两种主要作用机制。研究结果表明灌注速率显著影响支架材料对细胞的物理截留能力，导致接种率随着灌注速率的增加而显著下降，而在相同灌注速率下，细胞与支架材料之间的特异性结合能力决定接种率的高低。通过对PET支架材料的胶原修饰，不仅可提高PET支架材料对细胞的物理截留能力，而且还有效改善PET纤维表面与细胞的特异性结合能力，从而使得PET支架的接种率得到显著提高。通过对灌注接种过程中细胞从悬液到达多孔材料表面并贴附的过程分析，并借鉴深层过滤模型建立了灌注接种的数学模型，可在一定范围内对灌注接种过程进行预测。通过考察静态培养条件下成纤维细胞在三维支架内的生长代谢和组织形成特性，结果表明在三维支架中成纤维细胞的比生长速率显著低于微载体二维培养条件，并且细胞的乳酸产率在2.0 mmol/mmol左右，即使采用灌注接种方式以均匀分布细胞，在经过4周静态培养后分布在胶原海绵支架上下表面100 μm范围内的细胞生长依然明显优于支架内部，说明静态培养条件下支架内部存在氧和营养物等的浓度限制，需要通过强化传质予以改善。 本文首次建立了灌注接种和灌注培养一体化的真皮组织体外灌注培养系统，并考察了灌注培养对成纤维细胞生长、代谢、基质表达和分泌的影响。结果表明，灌注培养能显著改善三维支架内的物质传递，从而促进细胞在三维支架中的增殖。在培养的前6天内细胞扩增了约7倍，比生长速率是静态培养的2倍，第6天时的细胞密度就超过了静态培养18天的细胞密度。另外，采用0.2 cm/min和0.8 cm/min的灌注速率构建人工真皮组织，在第12天时支架中的胶原含量就可达到并超过静态培养18天的组织，大大缩短真皮组织构建所需的时间。定量PCR结果显示，0.2 cm/min和0.8 cm/min的灌注速率下细胞第6天时的I型胶原基因表达受到了上调，提示培养基流动产生的剪切力可能对成纤维细胞的基质表达具有促进作用。 上述研究结果表明，采用灌注接种与灌注培养技术体外构建组织工程真皮组织，不仅可以显著提高种子细胞在三维支架材料中的接种效率和分布均匀性，而且还可从根本上消除组织构建过程中的传质限制，改善支架材料内部细胞生长的微环境，促进细胞在支架材料中的增殖和基质沉积，从而为确保体外构建的工程化真皮的组织均一性和质量稳定性提供了技术保证。另外，本文研究结果也将有助于认识三维支架材料内细胞生长、代谢、基质表达、组织发育与培养环境之间的关系，为建立高效稳定的规模化组织工程皮肤体外构建过程及其生物反应器系统提供科学指导，同时对其它人体组织的体外构建过程研究也具有一定参考意义。