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目的:本课题组前期研究显示,27nt-miRNA由内皮型NOS(eNOS)的第4内含子27碱基重复序列产生,并负性调控eNOS的转录水平和蛋白表达水平。本研究进一步探讨27nt-miRNA对eNOS表达、活性的调节及代谢产物NO的生成、血管新生的影响及相关分子机制研究:1)研究27nt-miRNA对血管内皮细胞eNOS基因表达的调节及其相关分子调控机制;2)明确27nt-miRNA对血管内皮细胞eNOS活性及其代谢产物NO生成的影响及其分子机制;3)阐明27nt-miRNA对细胞增殖、迁移和管腔形成的影响及其相关分子机制,为分子水平治疗心血管疾病提供理论依据。方法:1)构建27nt-miRNA野生型与突变型基因序列的高表达质粒,使用X-treme GENE HP DNA脂质体进行转染,根据所染的质粒将人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)分为:空白质粒对照组(Control group)、野生型27-nt-miRNA质粒组(Wt-27-ntmiRNA组)和突变型27-nt-miRNA质粒组(Mut-27-nt-miRNA组)。2)检测27nt-miRNA对eNOS基因表达的影响:将空白质粒、Wt-27-ntmiRNA质粒和Mut-27-nt-miRNA质粒转染入HUVECs。应用RT-PCR实验检测eNOS mRNA和核转录因子AP-1 mRNA转录水平的改变;应用免疫细胞化学实验(Immunocytochemistry)和免疫印迹实验(western blotting)检测eNOS蛋白和核转录因子AP-1蛋白表达水平的改变。3)检测27nt-miRNA对eNOS活性及其代谢产物NO生成的影响:将空白质粒、Wt-27-nt-miRNA质粒和Mut-27-nt-miRNA质粒转染入HUVECs。应用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定不同时间细胞培养液中eNOS活性的变化;应用硝酸还原法测定不同时间细胞培养上清液中NO生成的变化。4)检测27nt-miRNA对HUVECs增殖的影响:将空白质粒、Wt-27-nt-miRNA质粒和Mut-27-nt-miRNA质粒转染入HUVECs。细胞转染消化后接种于96孔板,并于24、48和72 h三个时间点,采用MTT法检测各实验HUVECs的增殖能力。5)检测27nt-miRNA对HUVECs迁移和管腔形成的影响:将空白质粒、Wt-27-nt-miRNA质粒和Mut-27-nt-miRNA质粒转染入HUVECs。细胞转染消化后接种于96孔板,采用划痕试验检测各组细胞的迁移能力;采用人工基底膜(Matrigel)检测各组细胞的管腔形成能力。结果:1)与对照组比较,27nt-miRNA高表达组eNOS mRNA和AP-1 mRNA转录水平明显降低(P<0.05),eNOS和AP-1蛋白表达明显下降(P<0.05)。2)与对照组比较,27nt-miRNA高表达组细胞培养液上清中eNOS活性明显减弱(P<0.05)及其代谢产物NO生成明显减少(P<0.05)。3)与对照组比较,27nt-miRNA高表达组的细胞增殖能力明显降低(P<0.05),迁移能力明显下降(P<0.05),血管新生面积比率也明显降低(P<0.05)。结论:1)27nt-miRNA显著抑制血管内皮细胞eNOS mRNA转录和蛋白表达,显著抑制核转录因子AP-1 mRNA转录和蛋白表达,AP-1的参与可能是这一调节过程的重要分子机制之一。2)27nt-miRNA显著抑制血管内皮细胞eNOS活性及其代谢产物NO的生成,并且可能与其对eNOS基因的调控表达有关。3)27nt-miRNA显著抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成能力,可能与其对eNOS基因的调控表达有关,并且eNOS/NO/可能是其调控的相关通路之一。