目的:失巢凋亡(脱离胞外贴附基质(extracellular matrix,ECM)诱导的细胞程序性死亡)能够抑制实体肿瘤细胞的转移,但大多数可转移的实体肿瘤细胞产生失巢凋亡抗性,是实体肿瘤细胞实现转移的生物学基础之一。细胞自噬是一种高度保守的自我降解途径,主要是通过溶酶体依赖的方式降解老旧细胞器和错误折叠的蛋白质并进行更新,也是一种细胞维持稳态的机制。细胞自噬能够提高脱离ECM后肿瘤细胞的失巢凋亡抵抗,从而促进肿瘤细胞的存活及转移。然而,肿瘤细胞命运的最终决定取决于失巢凋亡与自噬之间相互的调节和平衡,而这一过程的分子调控机制尚不完全清楚。我们的前期研究结果显示信号衔接蛋白p66Shc通过激活Rho A促进细胞失巢凋亡从而抑制肿瘤的转移,p66Shc蛋白缺失能够减弱营养缺乏诱导的细胞自噬水平,提示p66Shc可能同时参与调控失巢凋亡与细胞自噬过程,并在二者的平衡上发挥重要功能。因此,为了验证这种假说,在本研究中,我们在体外模拟人非小细胞肺癌细胞脱离ECM后,通过检测自噬的标志蛋白(如,LC3B,p62/SQSTM1及Beclin1)以及自噬流量(Monodansylcadaverine(MDC)及Lyso Tracker双染色),以探讨p66Shc蛋白在调控肿瘤细胞失巢凋亡与细胞自噬机制中发挥的作用,为进一步了解肺癌细胞的转移机制,以及为治疗肿瘤转移寻找分子治疗靶点提供实验依据。方法:本论文为两部分,第一部分主要研究在体外模拟肿瘤细胞脱离ECM后,通过Western blotting检测p66Shc蛋白在人永生化表皮细胞BEAS-2B及人肺腺细胞A549中的表达情况,以验证p66Shc蛋白是否参与调控细胞失巢凋亡的机制。同时用细胞凋亡检测试剂盒测定BEAS-2B细胞和A549细胞在与ECM脱离1-3天后的细胞凋亡情况。由于p66Shc蛋白在A549细胞中随着悬浮时间的延长其表达逐步升高,随后利用sh RNA下调p66Shc的表达,通过Western blotting检测与自噬相关分子(如,LC3B,p62及Beclin1)蛋白水平的变化,并通过MDC及Lyso Tracker双染色检测自噬流量的变化情况。第二部分利用RT-PCR及Western blotting检测在A549细胞脱离ECM后与p66Shc蛋白共同参与调控失巢凋亡与细胞自噬过程的其它蛋白的变化,以进一步探讨p66Shc蛋白在调控A549细胞在失巢凋亡与自噬性细胞存活机制中所发挥的生物功能和机制。结果:第一部分实验结果表明,与对照的贴壁培养细胞相比,随着悬浮时间的延长,p66Shc蛋白在人永生化表皮细胞BEAS-2B及人肺癌表皮细胞A549中的表达量都明显增高,表明脱离ECM能够诱导p66Shc表达。同时检测BEAS-2B细胞与A549细胞悬浮状态与贴壁状态下细胞死亡情况,和sh RNA对照细胞相比,sh RNA下调p66Shc表达后,悬浮培养的BEAS-2B细胞与A549细胞死亡明显降低,表明p66Shc参与失巢凋亡的调控。随后,我们对悬浮的以及贴壁的A549细胞自噬水平的标志性蛋白(LC3B,p62和Beclin1)进行了Western blotting检测。与对照细胞相比,下调p66Shc后,贴壁细胞中细胞自噬流量明显减弱(LC3B-I向LC3B-Ⅱ的转换,p62蛋白的降解);在悬浮培养条件下,下调p66Shc后增加了LC3B-Ⅱ和p62的积累,但p62的积累程度随时间降低,表明细胞自噬流量增加,对照细胞中自噬流量变化不大,Beclin1的表达水平也无明显变化。MDC及Lyso Tracker的染色也表明下调p66Shc后,脱离ECM后所诱导的自噬水平相应地降低了,表明p66Shc对于贴壁和悬浮条件下的细胞自噬和失巢凋亡的平衡起一定的维持作用。第二部分实验,为了进一步揭示p66Shc蛋白在肿瘤细胞与ECM脱离后如何通过调节自噬的产生从而抑制细胞凋亡因而增加肿瘤细胞的存活,我们对潜在的受p66Shc调控的分子进行m RNA及蛋白水平检测,以便找到更多的调控蛋白。结果显示多种分子与p66Shc共同参与了肿瘤细胞与ECM脱离后的失巢凋亡与细胞自噬的调控,如XAF1,和MINK1等。其中下调p66Shc增加XAF1蛋白水平和MINK1 m RNA水平。结论:p66Shc对于贴壁和悬浮条件下的细胞自噬和失巢凋亡的平衡起一定的维持作用,能够通过改变LC3B-I向LC3B-Ⅱ的转化,以及p62蛋白的降解并且以一种不依赖Beclin1的方式进行,这种对自噬流量的调控显著影响了肿瘤细胞的存活,可能的机制是p66Shc的缺失诱导XAF1和MINK1的表达增加,这为进一步了解实体肿瘤细胞中p66Shc参与的细胞自噬和失巢凋亡的相互调控提供了实验基础。