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1 研究背景和目的在我国,贲门腺癌的定义存在分歧并争论已久。由于贲门与下段食管接连,这两个部位发生的肿瘤在临床表现、高发地区和诊治等方面有很多共同特点;同时,贲门又与胃具有特殊解剖毗邻,所以贲门腺癌先后被我国专家和学者归入食管癌和胃癌进行统计;而在西方的一些国家,目前将其按照食管胃交界部腺癌进行统计。在我国的临床实践工作中,各位专家和学者对食管胃结合部腺癌的定义也存在一定混淆。我国外科专家组在2018年版《食管胃结合部腺癌外科治疗中国专家共识》中表明,食管胃结合部是指食管与胃之间结合处的虚拟解剖交界线,建议我国的食管胃结合部腺癌采用Siewert分型。本研究中的贲门腺癌是指肿瘤中心位于食管胃解剖交界线下方2cm内的癌,属于Siewert Ⅱ型。长期以来,贲门腺癌TNM（Tumor-Node-Metastasis）分期划分也有争议:美国癌症联合会（American Joint Committee on Cancer,AJCC）和国际抗癌联盟（Union for International Cancer Control,UICC）联合发布的第 7 版TNM分期系统将贲门腺癌归入食管腺癌分期系统进行划分,但有学者提出将其归入胃癌分期系统更为合理;第8版AJCC/UICC TNM分期系统对食管腺癌分期系统的亚组进行了重新定义,贲门腺癌继续沿用食管腺癌分期系统。由于贲门腺癌的定义、诊断、编码和分期存在诸多争议,有关中国真正贲门腺癌的流行病学资料仍然比较少,而该病发病率呈逐年上升趋势。因此,我们通过对来自省部共建食管癌防治国家重点实验室的13,970例贲门腺癌患者临床资料进行分析和总结,为了解我国贲门腺癌的临床流行特征、预后影响因素和肿瘤防治提供重要依据。贲门腺癌是在环境危险因素、癌基因和抑癌基因的共同影响下并长期相互作用的结果。认识和掌握贲门腺癌预后影响因素和癌变分子机制对其早期干预和靶向治疗具有重要意义。特异性生物标志物变异和异常表达与肿瘤发生和预后密切相关,寻找贲门腺癌特异性肿瘤标志物对其诊断和精准治疗十分必要。本研究的第一部分,我们主要描述贲门腺癌的临床流行病学特征和预后影响因素;在第二部分,我们从基因和蛋白水平探讨贲门腺癌患者的分子改变,探索其可能癌变机制。我们对523例贲门腺癌患者癌组织和相应正常组织样本进行高通量测序,筛选与生存相关的高频突变基因,进一步制作大样本组织芯片,利用免疫组化技术检测这些基因在2,643例患者癌组织中的蛋白表达情况,探讨相关基因和蛋白表达异常对患者生存的影响,为明确贲门腺癌的癌变机制、临床诊断、治疗和预后提供一定线索和依据。基于第二部分研究结果,在第三部分我们对影响患者生存的2个高频突变基因（PREX2和COL12A1）进行过表达或沉默,在细胞系中初步探讨这两个基因的细胞生物学功能。2 材料与方法2.1 贲门腺癌的流行特征和生存分析2.1.1 研究对象在本回顾性研究中,共纳入13,970例来自于省部共建食管癌防治国家重点实验室50万例食管癌及贲门癌临床信息及生物样本大数据库（1973-2020年）的贲门腺癌患者。13,970例患者中,男性11,050例（79.1%）,平均年龄62.4±8.5岁;女性2,920例（20.9%）,平均年龄62.2±8.6岁。2.1.2研究方法将患者的临床病理信息进行收集、录入和整理,并根据患者的联系方式和家庭住址进行随访。采用SPSS 21.0进行数据的统计分析。应用描述性研究方法,对患者的一般信息和临床病理信息进行分析和描述,运用Kaplan-Meier法分析各临床病理特征对患者生存的影响。运用多因素Cox比例风险回归模型进一步筛选出与患者生存相关的独立因素。2.2 贲门腺癌全外显子组测序（Whole exome sequencing,WES）和目标区域测序（Target region sequencing,TRS）以及高频突变基因在癌组织中的蛋白表达2.2.1 研究对象本研究中,共纳入523例贲门腺癌患者进行WES（112例）和TRS（411例）。在免疫组化试验中,共纳入2,643例贲门腺癌患者的癌组织标本用以制作组织芯片,并进行相关蛋白表达检测。2.2.2 研究方法（1）DNA提取;构建相应的DNA文库,质检合格后,采用Illumina测序平台分别进行WES和TRS;在评估测序数据质量后,将测序数据进行生物信息学分析,并结合患者的临床表型进行相关分析,筛选出影响患者生存的高频突变基因。（2）根据第一部分结果中得到的对患者生存有影响的高频突变基因,我们应用免疫组化技术检测高频突变基因（PREX2和COL12A1）在癌旁和癌组织中的蛋白表达情况,并进一步利用大样本量癌组织样本分析蛋白表达对贲门腺癌患者生存的影响。2.3 PREX2和COL12A1基因的细胞生物学功能2.3.1 研究对象胃粘膜上皮永生化细胞GES-1、胃腺癌细胞系SGC-7901、胃腺癌细胞系MGC80-3和胃腺癌细胞系AGS。2.3.2 研究方法结合第二部分的研究结果,我们选取PREX2和COL12A1作为目的基因,并采用CRISPR-Cas9技术进行基因的过表达或敲除,在细胞系中研究这两个基因的细胞生物学功能。采用统计软件（SPSS 21.0）进行相关数据分析。采用t检验进行2个样本间均数的比较。3结果3.1 贲门腺癌的流行特征和生存分析3.1.1 贲门腺癌患者的临床病理特征13,970例患者中:男女比例为3.78:1;高发年龄为≥60岁（65.2%）;高发区患者（53.2%）所占比例高于低发区患者（46.8%）;有家族史信息的11,084例患者中,家族史阴性患者（7,795例,70.3%）所占比例明显高于家族史阳性患者（3,289例,29.7%）;半数以上患者的肿瘤分化程度呈低分化（55.4%）;肿瘤的T分期以T3（79.8%）为主;有淋巴结转移患者（N1+N2+N3:64.2%）所占比例明显高于无淋巴结转移患者（N0:35.8%）;绝大多数患者无远处转移（M0:99.2%）,仅极少数患者有远处转移（M1:0.8%）;早期癌（0+I）患者的检出率仅为9.4%,绝大多数患者处于中晚期（Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ:90.6%）;少数患者（4.7%）脉管癌栓阳性;7.7%的患者切缘阳性。患者的中位随访时间为6.8年。患者的1年、3年和5年整体生存率分别是87.7%、60.2%和44.1%。3.1.2 贲门腺癌患者生存影响因素的单因素分析女性患者的整体生存状况较男性患者明显更好（P=0.028）;确诊年龄＜60岁患者的整体生存明显优于≥60岁患者（P＜0.001）;低发区患者的整体生存状况要明显好于高发区的患者（P=0.047）;家族史阳性患者较阴性患者的整体生存更好（P＜0.001）;肿瘤的分化程度越低,患者的整体生存越差（P＜0.001）;肿瘤T分期越重,患者整体生存越差（P＜0.001）;肿瘤N分期越重,患者整体生存越差（P＜0.001）;无远处转移患者整体生存优于有远处转移患者（P＜0.001）;TNM分期越晚,患者的整体预后也越差（P＜0.001）;脉管癌栓阴性患者整体生存优于脉管癌栓阳性患者（P＜0.001）;切缘阴性患者的整体生存明显优于切缘阳性患者（P＜0.001）。3.1.3 贲门腺癌患者生存影响因素的多因素分析多因素生存分析:男性、确诊年龄≥60岁、高发区、分化程度越低、T分期越重、N分期越重、M1、脉管癌栓阳性和切缘阳性是影响贲门腺癌患者生存的独立危险因素。3.2 贲门腺癌WES和TRS结果以及高频突变基因在癌组织中的蛋白表达3.2.1 523例贲门腺癌患者的临床病理特征523例患者:男女比例为3.63:1;患者高发年龄为≥60岁（65.6%）;高低发区比例为2.29:1;早期癌患者的检出率非常低（2.5%）,绝大部分患者为中晚期（97.5%）。3.2.2 贲门腺癌患者的体细胞突变对WES和TRS的数据进行综合分析,523例贲门腺癌患者,共发生了 92,939个突变。外显子编码区共发生了 21,727个突变,包括21,133个单核苷酸变异（Single nucleotide variant,SNV）（97.3%）和 594 个小片段的插入与缺失（Insertion and Deletion,InDel）（2.7%）。SNVs突变以错义突变为主（69.4%）,InDels突变以移码缺失突变为主（47.2%）。3.2.3 高频突变基因我们共筛选出114个高频突变基因,其中13个基因能够影响患者的生存。因该部分研究结果尚未正式发表,我们重点描述PREX2和COL12A1基因。PREX2基因的突变频率为6.88%（36/523）,PREX2基因高突变率与较大的确诊年龄和脉管癌栓阳性有关,且其突变组患者生存差于不突变组（P=0.002）。COL12A1基因的突变频率为7.07%（37/523）,其基因突变与临床病理特征无统计学相关性,但其突变组患者生存差于不突变组（P=0.007）。3.2.4 PREX2和COL12A1基因突变与癌组织中蛋白表达关系523例患者中,有368例患者癌组织同时进行了免疫组化实验并检测了PREX2蛋白表达情况。PREX2基因是否突变与该基因在癌组织中的蛋白表达情况无统计学相关性。523例患者中,有334例患者癌组织同时进行了免疫组化实验并检测了COL12A1蛋白表达情况。COL12A1基因是否突变与该基因在癌组织中的蛋白表达情况也无统计学相关性。3.2.5 癌组织和癌旁组织PREX2蛋白和COL12A1蛋白表达情况我们采用免疫组化技术分别检测75例贲门腺癌患者癌组织和癌旁组织中PREX2蛋白和COL12A1蛋白表达情况。PREX2蛋白在癌组织中的阳性表达率明显低于其相应的癌旁组织（48.0%vs.85.3%,P＜0.001）,而COL12A1蛋白在癌组织中的阳性表达率高于其相应的癌旁组织（66.7%vs.49.3%,P=0.047）。3.2.6 2,643例癌组织样本中PREX2蛋白和COL12A1蛋白表达情况及与生存关系PREX2蛋白阳性率为43.9%（1,161/2,643）,PREX2蛋白表达与高/低发区、分化程度、T分期、N分期和TNM分期相关,PREX2蛋白阳性表达患者的整体生存明显优于阴性表达患者。PREX2蛋白阳性表达是贲门腺癌患者生存的独立保护因素。COL12A1蛋白阳性率为43.9%（1,159/2,643）,COL12A1蛋白表达仅与切缘情况有相关性,且切缘阳性患者COL12A1蛋白表达阳性率明显高于切缘阴性患者（52.7%vs.43.4%,P=0.037）。COL12A1蛋白阳性表达患者的整体生存明显差于阴性表达患者。COL12A1蛋白阳性表达是贲门腺癌患者生存的独立危险因素。3.3 PREX2基因和COL12A1基因的细胞生物学功能PREX2基因过表达可以抑制胃癌SGC-7901细胞增殖、细胞周期发生S/G2期阻滞、促进细胞凋亡,并抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力;促进E-Cadherin和β-Catenin表达上调,抑制上皮间质转化过程。可初步推测PREX2基因可能是一个候选抑癌基因。COL12A1基因敲除可以抑制胃癌MGC80-3细胞增殖、细胞周期发生G2/M期阻滞和抑制肿瘤细胞的迁移能力;可初步推测COL12A1基因可能是一个候选癌基因。4结论（1）贲门腺癌患者早期癌检出率比较低,大多数患者在确诊时已经处于中晚期;男性、确诊年龄≥60岁、高发区、分化程度越低、T分期越重、N分期越重、M1、脉管癌栓阳性和切缘阳性是影响贲门腺癌患者生存的独立危险因素。（2）PREX2基因突变患者生存差于不突变患者,癌组织中PREX2蛋白表达阳性是影响贲门腺癌患者生存的独立保护因素;COL12A1基因突变患者生存差于不突变患者,癌组织中COL12A1蛋白表达阳性是影响贲门腺癌患者生存的独立危险因素;（3）PREX2基因可能是一个候选抑癌基因,COL12A1基因可能是一个候选癌基因。