研究背景放射治疗被广泛用于治疗儿童原发性或转移性颅脑肿瘤患者。在标准的放射治疗方案中,无论是全脑放射治疗还是局部分次照射,除了杀伤肿瘤细胞外,大脑正常组织也不可避免地会受到射线的损害,许多患者出现了颅脑放射治疗相关的并发症,例如局灶性神经功能缺损、学习和记忆功能障碍、认知障碍、行为异常、内分泌代谢紊乱等。尽管现代放疗技术不断改进,放射性脑损伤仍然是不可忽视的并发症,值得临床医生加以重视。放射性脑损伤是指在电离辐射照射后神经细胞和颅内血管受损后出现的一系列病理生理改变,在临床上可分为急性期、早迟发期和晚迟发期。放射线可直接诱导DNA损伤,也可以通过反应性自由基的产生间接诱导DNA损伤。DNA损伤还可逃脱细胞修复机制的束缚,并引发多种细胞反应,包括细胞周期和有丝分裂停滞、细胞坏死或凋亡诱导的细胞死亡。在颅脑照射后,还可能诱发微脉管系统损伤导致血脑屏障通透性增加,并出现淋巴细胞浸润,持续的慢性炎症以及细胞因子和粘附分子的释放可能导致少突胶质细胞胶质增生和脱髓鞘,与脑白质坏死密切相关。在幼年阶段,此时的大脑处于未成熟时期,神经干细胞/祖细胞具有很高的增殖能力,极易受到照射的损伤,照射诱导的细胞死亡在很大程度上与细胞凋亡关系密切。因此,为了减轻放射性脑损伤,预防照射引起的神经干细胞/祖细胞死亡是目前的一个研究热点。自噬是真核细胞中一种进化上高度保守、依赖溶酶体的细胞循环途径,它可以循环细胞质成分,在细胞适应和清除细胞内病原体中起关键作用。Atg7作为经典的自噬相关基因,在自噬体形成的起始阶段发挥了重要的作用。最近的研究表明,Atg7参与了多种幼年小鼠脑损伤模型的调控,表明Atg7可能作为治疗干预脑损伤的潜在靶点。前期在幼年动物模型中的研究表明,自噬的不适当激活可能直接参与介导了细胞死亡,或引发细胞凋亡和细胞坏死性死亡,然而,自噬在幼年小鼠放射性脑损伤中的作用仍不明确。在本研究中,根据幼年小鼠大脑的发育特点,我们主要探索幼年小鼠照射后急性期（照射后6小时）和照射后亚急性期（照射后5天,相当于临床上的早迟发期）的脑损伤情况。本研究采用神经细胞Atg7基因敲除小鼠,通过构建放射性脑损伤模型,从转录组学和蛋白水平探索自噬在幼年小鼠放射性脑损伤急性期和亚急性期中的作用及其机制,为临床预防和治疗放射性脑损伤提供了新的理论依据和治疗策略。第一部分 自噬在幼年小鼠照射后急性期脑损伤中的作用目的放射疗法是治疗恶性颅脑肿瘤的有效方法。然而在照射后急性期,照射可诱导神经干细胞/祖细胞死亡,与放射性脑损伤的并发症密切相关。预防照射后急性期诱导的神经干细胞/祖细胞的死亡仍是目前治疗放射性脑损伤亟待解决的问题。目前,自噬已被证明与细胞死亡关系密切,但自噬在放射性脑损伤中的作用仍不明确。本部分的研究目的是评估抑制自噬水平对幼年小鼠照射后急性期脑损伤中的作用。方法对10日龄的神经细胞Atg7基因敲除小鼠和对照组小鼠进行单次剂量6Gy的全脑照射。在照射后6小时（急性期）,评估海马齿状回和小脑中神经细胞死亡、细胞凋亡、神经干细胞/祖细胞增殖以及小胶质细胞的激活情况。结果在照射后6小时,Atg7基因敲除小鼠和对照组小鼠神经干细胞/祖细胞死亡和caspase-3依赖性细胞凋亡均显著增加,神经干细胞/祖细胞增殖能力降低,激活型小胶质细胞显著增加。而在照射后6小时与对照组小鼠相比,Atg7敲除减轻了齿状回中60%和小脑中19%的照射诱导的核固缩细胞死亡,同时也减轻了caspase-3依赖性细胞凋亡;Atg7敲除可减轻照射后6小时的小胶质细胞激活;Atg7敲除对照射后6小时神经干细胞/祖细胞的增殖无明显影响。结论抑制自噬水平减轻了幼年小鼠照射后急性期的神经干细胞/祖细胞死亡和caspase-3依赖性细胞凋亡,减轻了小胶质细胞的激活,从而对幼年小鼠照射后急性期脑损伤有保护作用。第二部分 自噬在幼年小鼠照射后亚急性期脑损伤中的作用目的放射疗法是治疗儿童恶性颅脑肿瘤的有效治疗手段,但是放疗过程中辐射对正常脑组织也会产生一定的副作用。前期的实验结果提示抑制自噬水平可以减轻照射后急性期脑损伤,本部分的研究目的是探索神经细胞Atg7基因敲除是否对幼年小鼠照射后亚急性期脑损伤具有持续的影响。方法对10日龄的神经细胞Atg7基因敲除小鼠和对照组小鼠进行单次剂量6 Gy的全脑照射。在照射后5天（亚急性期）,评估海马齿状回和小脑的体积变化、神经干细胞/祖细胞增殖和小胶质细胞激活情况,以及皮层下白质和小脑白质的髓鞘发育情况。结果在照射后5天,Atg7敲除组和对照组小鼠全脑未见明显核固缩细胞,海马齿状回颗粒层体积和小脑体积在照射后5天明显缩小,神经干细胞/祖细胞的增殖降低,皮层下白质和小脑白质出现损伤,少突胶质祖细胞丢失增多。在照射后5天,MBP染色结果显示Atg7敲除组小鼠MBP阳性体积在照射后显著高于对照组小鼠（皮层下白质区域:敲除组1.14±0.06 mm3 vs.对照组0.90±0.04 mm3,p=0.037;小脑白质区域:敲除组 1.94±0.11 mm3 vs.对照组 1.46±0.06 mm3,p=0.001）。而PDGFRα染色结果显示Atg7敲除组的PDGFRα阳性细胞密度在照射后与对照组相比其PDGFRα阳性细胞密度更高（皮层下白质区域:敲除组82.9±3.1 cells/m2 vs.对照组 67.2±2.4 cells/m2,p=0.033;小脑白质区域:敲除组 110.8 ± 4.6 cells/mm2 vs.对照组 88.2 ± 3.7 cells/mm2,p=0.033）。Atg7 敲除对幼年小鼠照射后5天的小胶质细胞和星形胶质细胞激活无明显影响。结论抑制自噬水平减轻了幼年小鼠照射后亚急性期照射诱导的少突胶质祖细胞丢失,减轻了照射诱导的脑白质损伤。第三部分抑制自噬水平减轻幼年小鼠放射性脑损伤的机制研究目的前期的研究显示抑制自噬水平减轻了幼年小鼠照射后急性期的神经干细胞/祖细胞死亡、caspase-3依赖性细胞凋亡和小胶质细胞的激活,同时也可减轻幼年小鼠照射后亚急性期的少突胶质祖细胞丢失和照射诱导的脑白质损伤。本研究将进一步探索抑制自噬水平减轻幼年小鼠放射性脑损伤的作用机制。方法对10日龄的神经细胞Atg7基因敲除小鼠和对照组小鼠进行单次剂量6 Gy的全脑照射。分别在照射后6小时（急性期）或照射后5天（亚急性期）比较各组小鼠的转录组学改变,并根据转录组学结果,评估细胞因子、细胞趋化因子以及线粒体分裂融合蛋白的表达情况。结果转录组结果分析显示,照射前、后出现了大量差异表达基因（DEGs）。GO（Gene Ontology,GO）term功能分析后结果显示,照射诱导的脑损伤与神经炎症通路和线粒体通路关系密切。GSEA富集分析结果表明,在照射后急性期,Atg7敲除小鼠和对照组小鼠之间的DEGs在神经炎症通路差异明显,而在照射后亚急性期,Atg7敲除小鼠和对照组小鼠之间的DEGs在线粒体基因表达通路差异显著。Luminex法检测细胞因子和细胞趋化因子的结果表明,Atg7敲除可以减少照射后急性期促炎因子的分泌,而Atg7敲除小鼠和对照组小鼠的细胞因子和细胞趋化因子水平在照射后亚急性期无明显差异。蛋白质印迹结果显示:在照射后急性期,线粒体融合蛋白OPA1、MFN1和线粒体分裂蛋白DRP1和FIS1的蛋白水平在Atg7敲除小鼠和对照组小鼠之间相比无显著差异。在照射后亚急性期,非照射状态下与照射后5天之间进行比较,线粒体融合蛋白OPA1和MFN1的蛋白水平在对照组小鼠中没有差异,而在Atg7敲除小鼠中却在照射后5天显著升高;同时发现,对照组小鼠的P-DRP1（磷酸化的DRP1,线粒体分裂被抑制的标记）蛋白水平在非照射状态和照射后5天之间无显著差异,而Atg7敲除小鼠的P-DRP1蛋白水平在照射后5天与非照射状态相比明显升高。结论1.在照射后急性期,抑制自噬水平可以减轻幼年小鼠放射性脑损伤,其机制可能是抑制自噬后减轻了促炎因子分泌,减轻了神经炎症的发生。2.在照射后亚急性期,抑制自噬水平可以减轻幼年小鼠放射性脑白质损伤,其机制可能是在照射后的线粒体分裂融合发生显著改变,照射后使自噬敲除小鼠的线粒体融合水平增强更加显著以及线粒体分裂水平抑制更加明显。