背景与目的特发性肺纤维化（Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF）是一种原因不明确的,慢性进行性致纤维化性的肺疾病,其组织病理学和放射学表现为寻常型间质性肺炎（usual interstitial pneumonia,UIP）,最终造成蜂窝肺和不可逆的肺损伤,呼吸衰竭,导致生活质量严重下降和死亡率增加。IPF约占所有间质性肺疾病中的20%,发病率高,其好发于老年人,男性多于女性,影响全世界约300万人。IPF发病机制极其复杂,容易误诊,且由于缺乏有效的药物治疗,无移植的IPF的中位生存期为3-5年,预后极差。因此,寻找特异性高的生物诊断标志物及开展新的靶点的作用机制研究对特发性肺纤维化的诊断和防治具有十分重要的意义。环状RNA（circular RNA,circRNA）是一类新型的非编码RNA,它们是在转录过程中首尾相连而成的共价闭合的连续环,在多种病理生理过程中起到关键作用。大多数circRNAs在物种间是非常丰富,稳定且保守的,并且通常表现出组织特异性表达模式。在近几年的热点研究中发现,功能性circRNAs在转录和转录后水平上参与调控基因表达的调控网络,其能够通过竞争性抑制微小RNA等机制影响包括肺纤维化、肺癌在内的多种疾病的发生发展。目前,尽管有关circRNAs的研究已经取得一些进展,但其在特发性肺纤维化中作用机制研究尚处于初步探索阶段,更多具有功能的circRNAs有待研究,其在调控网络中的作用机制尚不完全明确。我们通过构建小鼠特发性肺纤维化模型,高通量测序分析IPF差异表达circRNAs,其中发现表达差异最为明显的mmu＿circ＿0001699,提示其可能在IPF的发生、发展中起到重要作用。本课题旨在初步探索mmu＿circ＿0001699在特发性肺纤维化发生、发展的作用及机制,为circRNAs成为特发性肺纤维化诊断生物标志物及潜在分子治疗靶点奠定科学实验基础。研究内容主要分为三个部分:第一部分,博来霉素诱导小鼠特发性肺纤维化模型中circRNAs差异性分析;第二部分,mmu＿circ＿0001699对肺成纤维细胞活化、增殖、迁移的调控作用;第三部分,mmu＿circ＿0001699在特发性肺纤维化发生发展的作用机制研究。第一部分 博来霉素诱导小鼠特发性肺纤维化模型中circRNAs差异性分析方法1.选取6-8周体重在22-26 g的C57BL/6J雄性小鼠,1%戊巴比妥钠针腹腔注射麻醉小鼠,经喉镜气管插管,气管套管内滴注2.5 u/kg的博来霉素（bleomycin,BLM）溶液后常规饲养28天,构建BLM诱导的小鼠特发性肺纤维化（BLM-IPF）模型。2.搜集BLM-IPF肺组织标本,经病理切片,HE及Masson染色观察肺纤维化病变情况,测定羟脯氨酸含量,并通过免疫荧光,qRT-PCR检测ColI,纤连蛋白（fibronectin,Fn）,α-SMA的表达情况,验证造模成功。3.选取3对IPF肺组织和正常肺组织标本行高通量二代测序,并进行差异性分析。运用生信分析软件,对差异表达circRNAs的parental基因进行基于Gene Ontology及KEGG的富集分析、circRNA与miRNA关联分析。4.qRT-PCR方法检测15对BLM-IPF小鼠肺组织和小鼠正常肺组织中circ＿0001699、circ＿0001084、circ＿0000368、circ＿0000831的表达情况。5.Divergent引物扩增、克隆测序验证特发性肺纤维化组织样本中存在环状的mmu＿circ＿0001699。结果1.经气管插管套管内滴注博来霉素溶液,获取BLM-IPF小鼠肺组织,病理切片后经HE及Masson染色观察到肺纤维化的典型病理表现;模型鼠较对照组羟脯氨酸含量明显升高（P＜0.05）;qRT-PCR、免疫荧光检测模型鼠中ColI,Fn,α-SMA的表达水平明显高于对照组（P＜0.05）。2.高通量测序技术检测分析3对肺组织标本中存在7168个环状RNA转录本,IPF组中表达上调的circRNAs 240种,表达下调的circRNAs 279种;生信分析显示60个circRNAs在两组间有明显差异表达（fold change＞2.0,P＜0.05）。3.对差异表达circRNAs的parental基因进行基于Gene Ontology分析显示,差异表达的环状RNA可能参与了向高尔基体内体的逆行运输、树突棘发育、通过miRNA产生涉及基因沉默的miRNA的生产、调节对活性氧的反应、突触融合蛋白结合、应力纤维组件的正调节等生物功能;KEGG分析表明其可能参与了TGF-β信号通路、细胞周期、局灶性粘连、细菌侵袭上皮、自噬、癌症中的转录失调等信号通路的调节。通过circRNA与miRNA关联分析预测4个差异表达最明显的circRNA调控的miRNA。4.与正常小鼠肺组织相比,BLM-IPF组circ＿0001699和circ＿0001084的相对表达水平明显升高,circ＿0000368和circ＿0000831的相对表达水平明显下降（P＜0.05）,与高通量测序结果一致。选定差异最为显著的mmu＿circ＿0001699进行下一步实验。5.Sanger测序结果显示与circBase中的mmu＿circ＿0001699序列完全一致,存在Smad1第2外显子首尾相接的BS位点,说明特发性肺纤维化组织样本中存在环状的 mmu＿circ＿0001699。第二部分 mmu＿circ＿0001699对肺成纤维细胞活化、增殖、迁移的调控作用方法1.通过原代培养技术分离、培养出生3天内的C57BL/6J小鼠原代肺成纤维细胞并鉴定,用1Ong/mLTGF-β 1（+/-）诱导原代肺成纤维细胞48h,显微镜下观察其形态变化,qRT-PCR检测TGF-β 1（+/-）诱导原代肺成纤维细胞后ColI,Fn,α-SMA的相对表达水平。qRT-PCR检测肺成纤维细胞中mmu＿circ＿0001699的表达。2.Divergent引物RT-PCR扩增、分子克隆及Sanger测序,验证原代成纤维细胞中存在环状的 mmu＿circ＿0001699。3.设计并合成特异性下调mmu＿circ＿0001699表达的siRNA及无关序列,利用脂质体LipofectamineTM3000转染至小鼠原代肺成纤维细胞中6-8 h,后经TGF-β1 诱导 48 h。qRT-PCR检测三组细胞(（si-circ＿0001699 组、si-NC组、Blank组）中mmu＿circ＿0001699的相对表达水平。4.qRT-PCR检测三组细胞（si-circ＿0001699 组、si-NC组、Blank组）中α-SMA,ColI及fibronectin的表达情况。5.通过EDU staining,MTT试验检测四组原代肺成纤维细胞（TGF-β 1组、TGF-β 1+si-NC组、TGF-β 1+si-circRNA组和Control组,前三组均经TGF-β1诱导,Control组未经TGF-β 1诱导）增殖功能。6.通过划痕试验,Transwell实验检测四组原代肺成纤维细胞（TGF-β 1组、TGF-β1+si-NC组、TGF-β1+si-circRNA组和Control组）迁移能力。7.将腺相关病毒（AAV）包装的mmu＿circ＿0001699 shRNA经气管内滴注到5周龄的C57BL/6 J雄性小鼠,气管内给药约30 μ L（2.0×1013 viral particles/mL）,继续饲养3周,给予滴注博来霉素溶液后常规饲养28天。Masson染色观察肺纤维化病变情况,qRT-PCR检测组织中ColI,Fn,α-SMA的表达情况;免疫荧光检测肺组织样本中α-SMA相对表达量。结果1.通过原代培养技术分离、培养并鉴定获取小鼠原代肺成纤维细胞,显微镜下可见典型的成纤维细胞形态。用1Ong/mLTGF-β 1诱导肺成纤维细胞,促使其异常活化,向肌成纤维细胞转化,同时介导了成纤维细胞的胶原合成和粘附过程,qRT-PCR检测TGF-β 1诱导后肺成纤维细胞中ColI,Fn,α-SMA的表达较对照组明显升高（P＜0.05）。与对照组相比,TGF-β 1诱导原代肺成纤维细胞中mmu＿circ＿0001699表达水平显著升高（P＜0.05）。2.Sanger测序证实原代肺成纤维细胞中存在Smad1第2外显子首尾相接的BS位点,说明细胞中存在环状的mmu＿circ＿0001699。3.下调mmu＿circ＿0001699后,qRT-PCR检测结果显示原代肺成纤维细胞组mmu＿circ＿0001699表达水平较对照组显著减低（P＜0.05）;qRT-PCR结果显示ColI,Fn及α-SMA的表达显著降低（P＜0.05）,提示下调mmu＿circ＿0001699可以抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞异常转化、胶原形成和粘连。4.EDU实验结果显示,下调mmu＿circ＿0001699可以显著降低si＿circ＿0001699组成纤维细胞的增殖（P＜0.05）;MTT实验结果显示,下调mmu＿circ＿0001699显著降低了 TGF-β 1诱导的成纤维细胞活力（P＜0.05）。提示mmu＿circ＿0001699参与调控TGF-β 1诱导的成纤维细胞增殖功能。5.Transwell实验结果显示,下调mmu＿circ＿0001699降低了 TGF-β 1诱导的成纤维细胞跨膜细胞数（P＜0.05）;用Image J软件计算划痕面积显示,si＿circ＿0001699组划痕愈合率明显低于对照组（P＜0.05）。提示下调mmu＿circ＿0001699可以抑制成纤维细胞的迁移功能。6.向小鼠气管内滴注AAV相关mmu＿circ＿0001699 shRNA,后给予滴注博来霉素溶液,Masson染色结果显示肺纤维化病变较对照组明显减轻;qRT-PCR检测组织中ColI,Fn,α-SMA的表达较对照组明显减低;免疫荧光显示肌成纤维细胞标志物（α-SMA）的表达量减少,P＜0.05,差异有统计学意义。结果提示,体内抑制mmu＿circ＿0001699可以显著减轻博来霉素诱导的特发性肺纤维化的发生、发展。第三部分 mmu＿circ＿0001699在特发性肺纤维化发生发展的作用机制研究方法1.生物信息学技术分析mmu＿circ＿0001699序列,预测与之相关的miRNA。利用双荧光素酶报告实验和RNA结合蛋白免疫沉淀实验（RIP）证实mmu＿circ＿0001699 与miR-98-5p相结合。qRT-PCR检测下调mmu＿circ＿0001699后原代肺成纤维细胞中miR-98-5p的表达水平。2.生物信息学技术分析miR-98-5p与HMGA2、Edn1存在靶向关系。双荧光素酶报告实验证实HMGA2、Edn1是miR-98-5p的靶基因。Western blot检测上调miR-98-5p对成纤维细胞中HMGA2和Edn1表达的影响。3.上调miR-98-5p表达,qRT-PCR检测肌成纤维细胞特异性标志物α-SMA的表达水平,免疫荧光检测细胞中α-SMA的平均荧光强度;应用MTT实验检测对肺成纤维细胞增殖能力的影响;应用Transwell检测对肺成纤维细胞迁移能力的影响。4.回复实验:使用不含3’ UTR区的HMGA2和Edn1重组载体pcDNA3.1-HMGA2 及 pcDNA3.1-Edn1,单独或共同与mmu＿circ＿0001699 siRNA或miR-98-5pmimics转染至肺成纤维细胞。通过免疫荧光检测细胞中α-SMA相对荧光强度反应对成纤维细胞异常活化的影响;通过MTT实验检测细胞增殖能力变化;通过Transwell实验检测细胞迁移能力的变化。结果1.生物信息学预测分析显示mmu＿circ＿0001699与miR-98-5p存在相互结合的互补区域。双荧光素酶报告实验结果显示,miR-98-5p mimics与WT＿circRNA＿pmirGLO组荧光素酶活性值明显低于其他三组（P＜0.05）;RIP结果显示Ago2共沉淀产物中,mmu＿circ＿0001699与miR-98-5p的丰度显著高于IgG阴性对照组（P＜0.05）,表明mmu＿circ＿0001699可与miR-98-5p特异性结合。下调mmu＿circ＿0001699后经TGF-β 1诱导的原代肺成纤维细胞中miR-98-5p的表达水平明显高于对照组（P＜0.05）,提示mmu＿circ＿0001699对miR-98-5p还具有负调控作用。2.生物信息学分析结果显示HMGA2、Edn1的3’ UTR区存在与miR-98-5p相互作用的互补区域;双荧光素酶报告显示miR-98-5p mimics与WT＿HMGA2＿pmirGLO或WT＿Edn1＿pmirGLO共转染组荧光素酶活性显著低于对照组（P＜0.05）;应用Western blot检测上调miR-98-5p肺成纤维细胞中HMGA2 和Edn1 的表达较其他两组（TGF-β1组,TGF-β1+miRNA scramble组）明显减低（P＜0.05）,表明miR-98-5p可靶向负调控HMGA2和Edn1。3.上调miR-98-5p后,qRT-PCR、免疫荧光检测结果显示α-SMA相对表达量及平均荧光强度均为显著下降（P＜0.05）;MTT实验结果显示上调miR-98-5p可以显著降低肺成纤维细胞的增殖能力（P＜0.05）;Transwell实验结果显示miR-98-5pmimics组穿膜细胞数显著低于对照组（P＜0.05）。结果提示上调miR-98-5p可以抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞异常转化、抑制成纤维细胞增殖和迁移功能,结合第二部分结果,提示下调mmu＿circ＿0001699与上调miR-98-5p对肺成纤维细胞效应一致。4.回复实验:pcDNA3.1-HMGA2和pcDNA3.1-Edn1过表达载体,同circ＿0001699 siRNA 或 miR-98-5p mimics 共同转染,可降低 circ＿0001699 siRNA或miR-98-5pmimics对肺原代成纤维细胞异常活化、增殖、迁移的抑制作用（P＜0.05）,差异有统计学意义。结果显示miR-98-5p不能作用于无3’UTR的HMGA2和Edn1,提示HMGA2和Edn1在miR-98-5p下游发挥调控作用。结论1.博来霉素诱导的小鼠特发性肺纤维化模型中存在众多差异表达的circRNAs,其中mmu＿circ＿0001699在特发性肺纤维化组织样本中高表达。2.下调mmu＿circ＿0001699可抑制肺成纤维细胞异常活化、增殖、迁移能力,减轻肺纤维化病变程度。3.在特发性肺纤维化发生、发展中,mmu＿circ＿0001699可通过miR-98-5p/HMGA2＆Edn1轴参与调控肺成纤维细胞的活化、增殖和迁移功能,有望成为新的诊断生物标志物和潜在的治疗靶点。