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研究背景:缺血性心脏病（ischemic heart disease,IHD）是导致患者死亡的重要原因之一。及时恢复缺血心肌的血液灌注是IHD的重要治疗措施,但血流灌注的恢复有时会导致缺血/再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury,IRI）。因此,有效减轻IRI对治疗IHD具有重要意义。间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）是细胞治疗的重要工具。研究发现,骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）可以通过旁分泌作用减轻多种组织的IRI,但BMSCs旁分泌的因子是否可以发挥与BMSCs相当的作用,从而替代BMSCs用于IHD和心肌IRI的治疗?该问题尚待阐明。为此,本研究拟从动物水平探讨BMSCs及BMSCs条件培养基（bone marrow mesenchymal stem cells-derived conditioned medium,BMSC-CM）改善心肌IRI的效果及效果差异,并进一步从细胞水平深入探讨BMSC-CM的作用机制。第一章BMSCs及BMSC-CM对大鼠心肌IRI的干预作用目的:在动物水平上探讨BMSCs及BMSC-CM对大鼠心肌IRI的干预作用及效果差异,并初步探讨其机制。方法:选择雄性SD大鼠72只,随机分为对照（control,Ctrl）组、缺血再灌注（ischemia reperfusion,IR）组、缺血再灌注+骨髓间充质干细胞（IR+BMSC）组和缺血再灌注+骨髓间充质干细胞条件培养基（IR+BMSC-CM）组。实验分为2个时间点:缺血45 min再灌注24 h和缺血45 min再灌注7 d,每组9只大鼠。除对照组外,其余组均结扎大鼠左冠状动脉前降支复制心肌IRI模型。IR组、IR+BMSC组和IR+BMSC-CM组大鼠心肌内分别注射磷酸盐平衡生理盐水（phosphate buffer saline,PBS）、BMSCs和BMSC-CM。24 h及7天后,收集血清和心脏标本。通过2,3,5氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyl tetrazolium chloride,TTC）染色检测心梗面积,原位末端标记法（Td T-mediated d UTP nick end labeling,TUNEL）染色检测心肌细胞凋亡,Masson’s染色检测心肌纤维化,免疫组化检测毛细血管密度。生化试剂盒检测肌酸激酶MB型同工酶（creatine kinase isoenzyme MB,CK-MB）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）和一氧化氮（nitric oxide,NO）,酶联免疫吸附技术（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法检测心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin-I,c Tn I）。提取左心室蛋白,免疫印迹（Western Blot,WB）检测凋亡相关蛋白（caspase3、Bcl2和Bax）和自噬相关蛋白（Beclin1、LC3和p62）。结果:（1）TTC染色结果显示:再灌注24 h,与对照组相比,IR组心肌梗死面积明显增加（p＜0.001）;与IR组相比,IR+BMSC组和IR+BMSC-CM组心肌梗死面积显著降低（p＜0.05,p＜0.01）;与IR+BMSC组相比,IR+BMSC-CM组心肌梗死面积无显著变化。再灌注7 d,对照组未见心肌梗死;与对照组相比,IR组心肌梗死面积明显增加（p＜0.001）;与IR组相比,IR+BMSC组和IR+BMSC-CM组心肌梗死面积显著降低（p＜0.05）;与IR+BMSC组相比,IR+BMSC-CM组心肌梗死面积无显著变化。TUNEL染色结果显示:再灌注24 h,IR组心肌细胞凋亡数显著增加（p＜0.001）;与IR组相比,IR+BMSC组和IR+BMSC-CM组心肌细胞凋亡数显著降低（p＜0.01）;与IR+BMSC组相比,IR+BMSC-CM组无显著变化。再灌注7 d,与对照组相比,IR组心肌细胞凋亡数增加（p＜0.001）;与IR组相比,IR+BMSC组和IR+BMSC-CM组心肌细胞凋亡数显著降低（p＜0.05）;与IR+BMSC组相比,IR+BMSC-CM组无显著变化。Masson’s染色结果显示:再灌注24 h,与对照组相比,IR组心肌纤维化显著增加（p＜0.001）;与IR组相比,IR+BMSC组和IR+BMSC-CM组心肌纤维化水平显著降低（p＜0.01,p＜0.001）;与IR+BMSC组相比,IR+BMSC-CM组心肌纤维化水平显著降低（p＜0.05）。再灌注7 d,与对照组相比,IR组心肌纤维化水平显著增加（p＜0.01）;与IR组相比,IR+BMSC-CM组心肌纤维化水平显著降低（p＜0.05）,IR+BMSC组无显著变化;与IR+BMSC组相比,IR+BMSC-CM组心肌纤维化水平无显著变化。免疫组化结果显示:再灌注24 h,与对照组相比,IR组心肌毛细血管数显著减少（p＜0.001）;与IR组相比,IR+BMSC组和IR+BMSC-CM组心肌毛细血管数显著增多（p＜0.001）。再灌注7 d,与对照组相比,IR组心肌毛细血管数显著减少（p＜0.05）,IR+BMSC-CM组心肌毛细血管数显著增多（p＜0.05）,IR+BMSC组无显著变化;与IR+BMSC组相比,IR+BMSC-CM组无显著差异。（2）生化指标显示:再灌注24 h后,与对照组相比,IR组CK-MB、LDH、c Tn I和NO水平显著增加（p＜0.05）;与IR组相比,IR+BMSC组和IR+BMSC-CM组CK-MB、LDH、c Tn I和NO显著降低（p＜0.05）;与IR+BMSC组相比,IR+BMSC-CM组无显著变化。再灌注7 d后,与对照组相比,IR组c Tn I和NO水平显著增加（p＜0.05）;与IR组相比,IR+BMSC组和IR+BMSC-CM组c Tn I显著降低,IR+BMSC-CM组NO水平显著降低,其余指标无显著变化;与IR+BMSC组相比,IR+BMSC-CM组各指标无显著变化。（3）WB结果显示:再灌注24 h,与对照组相比,IR组心肌caspase3的表达增加（p＜0.05）、Bcl2/Bax的比值降低（p＜0.001）、Beclin1和LC3的表达有降低趋势、p62的表达增加（p＜0.01）;与IR组相比,IR+BMSC组心肌caspase3的表达有降低趋势、Bcl2/Bax的比值增加（p＜0.001）、Beclin1和LC3的表达有增加趋势、p62的表达降低（p＜0.001）,IR+BMSC-CM组心肌caspase3的表达降低（p＜0.05）、Bcl2/Bax的比值增加（p＜0.01）、Beclin1和LC3的表达增加（p＜0.05,p＜0.01）、p62的表达降低（p＜0.001）。再灌注7 d,与对照组相比,IR组心肌caspase3的表达增加（p＜0.05）、Bcl2/Bax的比值有降低趋势、Beclin1有增加趋势、LC3的表达增加（p＜0.05）、p62的表达降低（p＜0.05）;与IR组相比,IR+BMSC组与IR+BMSC-CM组caspase3的表达降低（p＜0.01）、Bcl2/Bax的比值增加（p＜0.01,p＜0.05）、Beclin1和LC3的表达降低（p＜0.05）,p62的表达增加（p＜0.01）;与IR+BMSC组相比,IR+BMSC-CM组各指标无显著变化。结论:（1）BMSCs和BMSC-CM可通过减少大鼠心肌细胞凋亡,促进血管新生,减轻心肌纤维化,从而减轻大鼠心肌IRI;其作用可能与细胞自噬有关。（2）BMSC-CM的效果与BMSCs相当,甚至更好。第二章BMSC-CM对心肌细胞缺氧/复氧损伤的干预作用及机制研究目的:建立心肌细胞缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）模型以模拟心肌IRI,探讨BMSC-CM对H/R心肌细胞的作用,并进一步阐明自噬在其中的作用及调节机制。方法:培养大鼠H9c2心肌细胞,建立H/R细胞模型并确定H/R损伤模型最适时间点。实验分为四组:对照（Ctrl）组、缺氧4小时/复氧24小时（H/R（4 h/24 h））组、缺氧8小时/复氧24小时（H/R（8 h/24 h））组及缺氧12小时/复氧24小时（H/R（12 h/24 h））组。用BMSC-CM处理H/R诱导的心肌细胞,实验分为三组,Ctrl组,H/R组,H/R+BMSC-CM组。分别用倒置显微镜观察细胞生长状态,细胞计数试剂盒（cell counting kit-8,CCK-8）检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平,试剂盒检测细胞培养液中LDH的含量,超分辨率共聚焦显微镜检测细胞线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,△Ψm）。WB检测凋亡相关蛋白cleaved-caspase3、Bax和Bcl-2的表达水平,自噬相关蛋白LC3、Beclin1和p62的表达水平,Notch信号相关蛋白Notch2活化体（N2ICD）和Hes1的表达水平,及其它信号通路相关蛋白PI3K、p-Akt、Akt、p-ERK、ERK、p-m TOR和m TOR的表达水平。结果:（1）随着缺氧时间延长,H/R诱导的H9c2心肌细胞损伤逐渐加重。与对照组相比,H/R（8 h/24 h）及H/R（12h/24 h）后,细胞数量明显减少,细胞的凋亡率显著升高,细胞内的ROS水平显著升高,细胞培养上清中LDH水平显著升高。因此,我们把H/R（8 h/24 h）作为后续实验的时间点。（2）与H/R组相比,H/R+BMSC-CM组心肌细胞数显著增多,细胞凋亡率及细胞内ROS水平显著降低,LDH水平显著降低,细胞△Ψm显著增加。（3）WB结果显示,与对照组相比,H/R处理增加细胞内cleaved-caspase3的表达,降低Bcl-2/Bax的比值,降低自噬蛋白LC3和Beclin1的表达,增加p62的水平。而BMSCCM能减少cleaved-caspase3的表达,增加Bcl-2/Bax的比值,增加LC3和Beclin1的表达,降低p62的水平。自噬抑制剂CQ或3-MA减弱BMSC-CM诱导的心肌细胞自噬水平,抑制BMSC-CM对H/R损伤细胞的保护作用。进一步对自噬相关通路分子表达的检测发现,H/R增加PI3K的表达,增加Akt和m TOR的活化,降低ERK的活化;而BMSC-CM降低PI3K的表达,降低Akt和m TOR的活化,增加ERK的活化。H/R还显著增加N2ICD和其下游靶分子Hes1的表达水平,而BMSC-CM则显著降低N2ICD和Hes1的表达。γ-分泌酶抑制剂DAPT（Notch信号通路抑制剂）能有效减少H/R处理的心肌细胞内N2ICD和Hes1的表达,提高心肌细胞存活率,降低cleaved-caspase3的表达,增加Bcl-2/Bax的比值,提高LC3和Beclin1的表达水平;DAPT还能降低Akt和m TOR的活化;且DAPT的效应与BMSC-CM相当。结论:（1）BMSC-CM能够减轻H/R所致的心肌细胞损伤;（2）BMSC-CM对H/R损伤心肌细胞的保护作用与Notch/Akt/m-TOR/自噬信号通路有关。它通过抑制Notch2信号活化,增加细胞自噬水平,减少心肌细胞凋亡,从而减轻H/R诱导的心肌细胞损伤。