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多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是一种常见的人类中枢神经系统炎性脱髓鞘病,实验性变态反应性脑脊髓炎(experimental allergic encephal omyelitis,EAE)是T细胞介导的动物中枢神经系统(central nervous system,CNS)自身免疫性脱髓鞘疾病,也是多发性硬化的经典动物模型。MS好发于20-40岁的中青年,表现为肢体的麻木和瘫痪,常复发缓解交替,严重影响了患者的工作和生活能力,故对于MS的研究一直是神经科学的热点和难点。我们以EAE为MS的动物模型,在组织、细胞及分子水平上探讨EAE的发病机制,并使用西药醋酸泼尼松,美满霉素,中药达那康(EGB761)进行治疗,可望明确EAE发病的病理生理学机制,并为临床选择有效药物提供实验依据。 本实验以英国短毛种豚鼠为研究对象,采用新鲜豚鼠脊髓匀浆与完全弗氏佐剂制备成的抗原乳剂,给动物行足底皮内注射,制造EAE动物模型。实验动物随机分为五组:正常组、模型组、醋酸泼尼松组、达纳康(EGB761)组、美满霉素组。正常组给完全弗氏佐剂和生理盐水,模型组给抗原乳剂和生理盐水,其余三组在给抗原乳剂后即日分别用灌胃法给醋酸泼尼松0.14mg/100g/日,达纳康1.67mg/100g/日,美满霉素1.10mg/100g/日。各组动物均在造模0,18,34天乙醚麻醉,内眦采血,留取血清,-80℃保存。并取实验前正常健康动物和实验中发病Ⅱ级以上动物血液,肝素抗凝,进行血常规测定。另外,同期取正常组动物及模型组发病Ⅱ级以上动物进行神经传导速度(MCV),脑干诱发电位(BAEP),体感诱发电位(SEP)检测。每日观察并记录动物发病状况。全部动物在免疫后五周处死,经心脏灌流,取脑和脊髓,多聚甲醛固定,病理切片,光镜观查;检测血清中的IL-10,IL-12水平;测定脑组织中转化生长因子TGF-β,基质金属蛋白酶MMP-2,一氧化氮合酶NOS,白细胞分化抗原CD3的表达情况。 结果显示:1、一般情况:与模型组相比,醋酸泼尼松和达纳康减少了EAE动物疾病起始期(第7—18天)和缓解后复发期(第23—35天)的临床评分(P<0.05)。美满霉素治疗组表现为与模型组相似的表现,甚至在复发期(第26—35天)其临床评分显著高于模型组(P<0.OS)。2、血常规检测:发病组较正常组外周血单核细胞数目(MO)、红细胞数目(RBC)、血红蛋白浓度(HGB)、红细胞压积(HCT)显著下降(尸<0 .05),平均血红蛋白含量(MCH)和血小板平均体积(MPV)显著上升(尸<0 .05),其余指标无明显变化。3、血清学结果:与正常组相比,其余四组豚鼠发病后血清工L一10增高(P<0 .05),其中醋酸泼尼松组和达纳康组IL一10水平明显高于模型组和美满霉素组,差异显著(尸<0 .05);IL一12水平第O天明显低于第18和34天,差异显著(P<0 .05),其中第18天IL一12水平最高。4、诱发电位结果:发病动物MCVRZ,MCVLZ数值与正常组相比明显下降(P<O.05),SEPNI波潜伏期延长(尸<0 .05),BAEP各波无异常。5、免疫组化结果:TGF一p在醋酸泼尼松组和达纳康组明显高于其余三组(尸<0 .05),余三组间无差别,此两组组间无差别;MMP一2正常组明显低于余四组,组间比较,醋酸泼尼松组和达纳康组均低于模型组和美满霉素组(尸<0.05),此两组组间各无差别;NOS模型组明显高于其余各组 (尸<0.05),余四组组间无差别;CD3正常组低于其余各组(尸<0 .05),其余各组组间无差别。6、病理学结果:与正常组相比,光镜下HE及LOYER染色观察发现模型组动物脑组织出现大量炎性浸润,尤以脑室周围比较明显。脑、脊髓实质内小血管周围有大量炎性细胞浸润,以淋巴细胞为主,形成血管套。神经元有坏死变性现象。脑、脊髓白质均见明显的髓鞘脱失,呈海绵状改变。可见胶质细胞增生,有的形成胶质结节。7、相关分析:工L一10与TGF一p明显正相关(尸<0 .05)。1L一12血清含量与疾病严重程度正相关(尸<0 .05)。咖P一2与NOS,CD3正相关护<0 .01)。 实验结论:1、一般情况:醋酸泼尼松和达纳康都可以推迟EAE发病和减轻疾病程度,美满霉素无效。2、血常规和诱发电位可作为多发性硬化的一项早期辅助诊断手段。3、IL一10,IL一12,TGF一p,枷P一2,NOS,CD3均参与了EAE的发病过程,其中工L一12,MMP一2,CD3及NOS可能促进疾病的发展,IL一10,TGF一p可能阻止疾病的发展,各因素互相联系相互作用,决定着EAE的严重或缓解程度。