【摘 要】
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目的:1.优化人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs）分离纯化方法,鉴定其生物学特性;2.探索使用中空纤维生物反应器扩增hUCMSCs的方法,并评价细胞扩增及衍生物分泌情况;3.构建基于hUCMSCs的新型生物人工肝系统,并评价其运行情况;4.评价基于hUCMSCs的新型生物人工肝系统对猪急性药物性肝衰模型的救治效
【基金项目】
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国家重点研发计划（2018YFC1106400）； 国家重点研发计划（2018YFA0108200）； 国家自然科学金（31972926）； 广东省基础与应用基础研究基金（2020A1515111111）； 广州市科技计划项目（201803010086）；
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目的:1.优化人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs）分离纯化方法,鉴定其生物学特性;2.探索使用中空纤维生物反应器扩增hUCMSCs的方法,并评价细胞扩增及衍生物分泌情况;3.构建基于hUCMSCs的新型生物人工肝系统,并评价其运行情况;4.评价基于hUCMSCs的新型生物人工肝系统对猪急性药物性肝衰模型的救治效果。方法:1.使用组织块法提取hUCMSCs的原代细胞,并将其逐步扩增、纯化;2.CCK-8法评价hUCMSCs增殖能力,观察细胞培养情况,诱导hUCMSCs多向分化,流式细胞仪鉴定细胞表面标志物;3.使用中空纤维生物反应器培养、扩增hU-MSCs;4.收集生物反应器培养基提取外泌体,并对外泌体粒径、表面标志物、浓度等检测;5.评价中空纤维反应器中hUCMSCs分泌外泌体分布情况;6.按照0.4g/Kg剂量给予D-Gal构建猪急性药物性肝衰竭模型;7.构建基于hUCMSCs的新型生物人工肝系统,通过检测其运行情况评价其稳定性与安全性;8.通过观察实验动物的一般情况、生存时间、肝功能、凝血功能、组织学等方面来评价基于hUCMSCs新型生物人工肝系统救治猪急性药物性肝衰竭的有效性及安全性。结果:1.组织块法可高效提取hUCMSCs,通过控制条件的传代,可在P3得到纯度较高的hUCMSCs,CCK-8增殖试验显示hUCMSCs具有良好增殖能力,可用于后续的研究;2.提取的hUCMSCs高表达CD73、CD90、CD105,低表达 CD45、CD11b、CD19、CD34、HLA-DR,具有成脂、成骨、成软骨三系分化能力;3.hUCMSCs可良好地贴附在中空纤维表面,通过中空纤维生物反应器可进行培育、增殖;4.使用中空纤维生物反应器培养hUCMSCs可获得含高浓度外泌体的培养基,外泌体粒径集中在50-130nm,其具有双层膜性结构,CD63、CD9、CD81、Syntenin、TSG101在外泌体与hUCMSCs上均表达阳性,Calnexin在hUCMSCs表达阳性,在外泌体中表达为阴性;5.使用BCA法测得中空纤维管纤维外腔与纤维内腔外泌体总蛋白含量相差不大;6.基于hUCMSCs新型生物人工肝系统运行过程中相关参数稳定,上机过程中实验动物生命体征平稳;7.基于hUCMCSs新型生物人工肝系统可有效降低猪肝衰模型的转氨酶、胆红素、血氨水平,改善凝血功能,降低血清中多种促炎因子水平;8.该新型生物人工肝系统可显著抑制肝细胞坏死,并促进肝细胞增殖再生;9.hUCMSCs发挥上述生物学功能存在剂量相关性。结论:本研究通过从分离到接种培养等一系列实验,证明了中空纤维生物反应器可作为hUCMSCs良好的培养与扩增手段。在此基础上,以含有hUCMSCs的中空纤维生物反应器为基础构建的新型生物人工肝系统,可通过调节炎症级联反应及内环境稳态途径,有效控制猪急性药物性肝衰竭的发展、促进肝脏再生,显著延长实验动物的生存时间。
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