前言随着通气策略的改变、产前糖皮质激素及生后肺表面活性物质的应用,越来越多的早产儿和极低出生体重儿得以存活,但支气管肺发育不良（Bronchopulmonary dysplasis,BPD）仍然存在,BPD是一种慢性肺疾病（Chroniclung disease,CLD）,通常发生在患透明膜病、接受氧疗、机械通气治疗的早产儿。目前多数人主张采用BPD命名,认为此命名可清楚的区分多种原因导致的CLD。早产儿BPD定义为生后28天或纠正胎龄（胎龄+日龄）36周仍需吸氧者,此定义更能准确地预测肺的预后。BPD临床表现主要为患儿依赖吸氧,在原发病基本改善后仍需要机械通气和吸氧,反复发生不易控制的肺部感染,呼吸困难明显,易发生CO₂蓄积和低氧血症,肺功能指标明显下降,部分患儿并发肺动脉高压和心力衰竭。重者多于生后一年内死于呼吸衰竭。存活儿也因肺功能障碍需长期（数月～数年）依赖氧气或呼吸机治疗,严重影响早产儿的生存质量,因其发病机制复杂,目前仍无有效的干预措施,因此探讨高氧机械通气致BPD的发病机制已成为当今新生儿领域研究热点之一。根据病理学特点BPD大体上可分为两种病变,一是炎性病变为主要表现的“传统BPD”,表现为肺组织内白细胞浸润、肺气肿、肺不张以及肺纤维化改变;二是肺发育阻滞为主要表现的“新型BPD”,表现为肺泡隔形成减少、微血管发育障碍、肺泡上皮增殖受抑制等。研究表明,氧自由基衍生物、炎症反应、机械通气能够损伤肺上皮细胞、毛细血管内皮细胞、抑制表面活性物质功能,抑制出生后肺泡、小呼吸道和小血管的发育,从而影响肺的成熟。炎症和氧自由基产物均可以诱导细胞凋亡,而呼吸机所致肺损伤（ventilator induced lung injury,VILI）是机械通气过程中的一个严重并发症,由气压伤、容积伤、不张伤及生物伤诱发肺损伤,随后发生BPD。肺发育由刺激和抑制因素之间的平衡引起,二个关键的调节器是糖皮质激素和转化生长因子-β。近年来随着转化生长因子-β₁（Transforming growthfactor-β₁,TGF-β₁）的深入研究,它在肺泡损伤、肺微血管发育受阻中的作用倍受关注。TGF-β₁是调节肺发育、细胞分裂、细胞外基质重建、呼吸道重建和调控炎症的主要调控器,这些作用共同促进BPD的发生,它参与肺损伤和修复相反两方面的机制,即它诱导了凋亡、感染、纤维化和肺泡重塑。它和其他细胞因子相互影响,对肺的发生、发展起着重要的调控作用。随着人们对细胞凋亡在肺损伤机制中作用的关注,线粒体凋亡途径成为目前研究的热点,凋亡及其他形式的细胞死亡途径中,线粒体通路是一个关键性步骤,在多种死亡模型中细胞色素C（Ccytochrome C,Cytc）从线粒体释放至胞质是引发凋亡的关键步奏。研究证实,肺组织细胞凋亡与急性肺损伤发生,发展密切相关,因此,探索早产儿BPD发生、发展中肺组织细胞的线粒体凋亡途径规律及调控机制,不仅可以完善肺泡发育障碍的发生机制,并可寻求新的干预措施。本实验利用新生兔BPD模型,观察支气管肺泡灌洗液（bronchial alveolarlavage fluid,BALF）白细胞计数、肺泡、肺微血管改变及肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的演变过程,同时,应用免疫组织化学染色、逆转录聚合酶链反应（Reversetranscription-polymerase chain raction,RT-PCR）及脱氧核糖核酸转移酶介导的X-dUTP缺口末端标记（Terminaldeoxynucleotide transferase- mediated X-dUTPnick end labeling,TUNEL）方法检测肺组织TGF-β₁、Cyt c的蛋白及mRNA的动态表达及细胞凋亡指数,以探讨①高氧吸入并机械通气致BPD新生兔肺损伤的影响;②转化生长因子β₁在肺损伤机制中的双重作用;③线粒体/细胞色素C凋亡途径在肺组织细胞凋亡的作用。实验材料及方法1动物模型日龄3～5天的新生新西兰兔96只,体质量为58.4±9.9 g。随机取24只为为正常对照组,给予空气吸入,未上呼吸机。余72只在西门子900C呼吸机上进行机械通气（Mechanical ventilation.,MV）（定压模式）,吸氧浓度为900 ml/L,随机分配在高吸气峰压（HPIP=2.45 kPa）、中吸气峰压（MPIP=1.77 kPa）、低吸气峰压（LPIP=0.98 kPa）三组,每组24只,呼吸末正压（Positive end expiratorypressure,PEEP）均为0.294kPa、呼吸频率均为50次/min、吸气时间均为0.33s。2标本采集和实验方法每组动物分别于通气开始后的1、3、6小时（h）三个时间点,每个时间点8只,切断颈总动脉放血处死动物,正常对照组也在相同时间点同样处死,行左肺支气管肺泡灌洗,用BALF作白细胞计数,中性分叶核细胞计数。取右肺中叶组织,RT—PCR检测肺组织TGF-β₁、Cyt C mRNA的表达。右肺下叶用来行免疫组织化学法检测肺组织TGF-β₁、CytC蛋白的表达,同时光镜、电镜下观察肺组织结构改变及TUNEL法检测肺组织细胞凋亡。结果1.高氧并机械通气对新生兔一般状态的影响正常新生兔精神好,活动好,反应灵敏,呼吸平稳,无发绀,肤色红润。通气新生兔撤机后精神差,反应差,肢体活动少,出现不同程度呼吸困难和发绀,以低压6h组明显,其次是高压6h组,中压1h组症状最轻。2.各组新生兔肺BALF白细胞计数、中性分叶核细胞计数的变化随着通气的进行,HPIP时肺组织反应较强,BALF中白细胞计数呈增加趋势,6h最为明显,均数最大,其次为LPIP,MPIP 3h到6h呈下降趋势,HPIP中性分叶核细胞计数3h最高,LPIP 6h明显增高,结合病理切片肺微血管变化和肺纤维增生观察结果,考虑高氧机械通气致炎症反应可能是肺微血管损伤的一个始动环节,由此导致的毛细血管闭塞是肺微血管减少的一个重要原因,成纤维细胞的异常增生也始于炎症反应最显著阶段。3.病理结果光镜观察:正常新生兔肺泡形态较规则,大小较一致,肺泡间隔无增厚。通气新生兔早期微血管发生炎性反应,随时间延长,微血管炎性反应加重,血管腔被中性粒细胞浸润和坏死的内皮细胞堵塞,间质出现毛细血管扩张、充血,其周围的成纤维细胞呈增生改变,最后产生大量胶原纤维、毛细血管闭塞,致使气血屏障增厚,3h时肺泡腔稍扩大,肺泡和毛细血管数目减少,6h时减少更明显,肺泡腔变狭长,甚至出现肺泡分隔增宽,肺间质细胞增多,毛细血管闭塞,以高压力组明显,低压组次之,低压力组以肺泡大小不均和萎陷、肺叶内局部肺不张、透明膜形成较明显。电镜观察:正常新生兔肺微血管较丰富,血管内皮结构完整,基底膜连续,血气屏障结构清晰,可见细胞连接。Ⅰ、Ⅱ型肺泡上皮细胞结构完整。通气组1h血管扩张,肺泡腔内有红细胞和中性粒细胞,肺间质内可见多形核白细胞浸润。6h时毛细血管明显减少,血管基底膜增厚,部分血管腔被炎细胞堵塞,肺间质内炎细胞浸润增多,胶原纤维增生,肺泡腔变窄长,Ⅱ型肺泡上皮细胞线粒体肿胀、板层小体破坏,Ⅱ型肺泡上皮细胞向Ⅰ型转化及坏死。上述改变以高压组及低压组明显,中压组变化稍小,且低压组肺泡腔受压,变窄长,毛细血管闭塞较明显。线粒体形态的动态变化与细胞凋亡同一时相。4.肺组织TGF-β₁蛋白含量及mRNA表达的动态变化通气肺组织中TGF-β₁ mRNA 1h增加,3h达高峰,高吸气峰压组水平最高,与其它组比较有意义,P＜0.05。TGF-β₁蛋白表达3h增加,6h达高峰,高吸气峰压组最显著,四组间比较有显著性差异,P＜0.01。蛋白表达高峰稍迟于基因表达,TGF-β₁蛋白表达灰度值（该值越低,表达越强）与WBC呈负相关,r=-0.612,P=0.000,说明TGF-β₁蛋白表达与WBC呈正相关关系。5.肺组织Cyt C蛋白含量及mRNA表达的动态变化随通气时间延长,肺组织Cytc mRNA表达增加及释放增加,以高吸气峰压细胞牵张伤所致表达最显著,随时间延长低吸气峰压不张伤致CytcmRNA表达增高及Cytc释放增加最明显。Cytc蛋白表达与凋亡指数呈正相关,r=0.747,P=0.000。与WBC呈正相关,r=0.628,P=0.000。结论1.未成熟肺高氧机械通气后出现肺泡分隔及数目减少、肺泡化程度减低、毛细血管减少到闭塞、肺纤维化的特点,且高吸气峰压细胞牵张伤所致损伤较重。2.未成熟肺机械通气后高吸气峰压细胞牵张伤致炎症反应强烈,随时间延长,低吸气峰压不张伤致肺组织出现较重的炎症性损伤。3.高氧机械通气氧化应激致TGF-β₁表达增高,以高吸气峰压最明显,初期促进肺泡及血管发育,进而抑制。4.未成熟肺高氧机械通气后肺组织Cytc表达增高,以高吸气峰压牵张伤最显著,随时间延长低吸气峰压不张伤表达增高最明显。Cytc表达与AEC-Ⅱ凋亡时线粒体形态的动态变化相关。5机械通气致线粒体合成、释放大量Cytc到胞质,致氧化应激反应,同时诱发caspase活化级联,导致细胞凋亡。