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目的:观察并比较通窍活血汤低剂量组、中剂量组、高剂量组对脑缺血再灌注损伤（Cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI）大鼠的神经保护作用,并从星形胶质细胞谷氨酰胺合成酶（GS）的蛋白酶体降解对抗谷氨酸兴奋性毒性角度探讨其作用机制。方法:选用SPF级成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠,随机分为假手术组和模型组,假手术组只分离血管,不进线;模型组采用改良线栓法建立大脑中动脉阻塞（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）大鼠模型,并在缺血2h后拔出线栓进行再灌注,以复制CIRI大鼠模型。造模成功的大鼠随机分为模型组、通窍活血汤低剂量组、通窍活血汤中剂量组、通窍活血汤高剂量组及阳性药丁苯酞组。通窍活血汤组中,根据人与大鼠的体表面积折算系数等效剂量为6.3g·kg-1·d-1,以等效剂量6.3g·kg-1·d-1为中剂量组,以中剂量的2倍即12.6 g·kg-1·d-1为高剂量组,等效剂量的1/2即3.15 g·kg-1·d-1为低剂量组。丁苯酞组按5.4 g·kg-1·d-1剂量灌胃,假手术组和模型组按等体积的生理盐水灌胃。造模后24h开始用药,连续治疗7天。观察大鼠一般情况,以m NSS神经功能缺损评分,评价大鼠神经功能恢复情况;HE染色观察大鼠脑组织的形态学变化,免疫荧光多重染色法检测大鼠脑组织中谷氨酸转运体-1（Glutamate transporter,GLT-1）、胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein,GFAP）、谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase,GS）、蛋白酶体20S共表达情况;羰基化试剂盒检测脑组织总蛋白及GS的羰基化情况;Western Blotting法检测大鼠缺血脑组织中GS、20S的蛋白表达;Co IP检测GS与20S蛋白互作情况。结果:1.各组大鼠在治疗前后用m NSS评价神经功能缺损情况。与治疗前相比,假手术组及模型组m NSS治疗后评分无显著差异（P＞0.05）;其它各治疗组治疗后m NSS评分显著降低,具有统计学意义（P＜0.05）。连续治疗7天后,与假手术组相比,模型组m NSS评分显著升高（P＜0.001）;与模型组相比,高剂量组、丁苯酞组m NSS评分显著降低（P＜0.001）,低剂量组,中剂量组虽有下降趋势,但无统计学意义（P＞0.05）。与低剂量组相比,高剂量组、丁苯酞组m NSS评分显著降低（P＜0.001）。与中剂量组相比,高剂量组m NSS评分显著降低（P＜0.001）。2.HE染色结果显示,假手术组大鼠脑组织细胞排列整齐,形态结构完整,细胞大小正常,核仁清晰。模型组脑组织缺血范围较大,颞顶部皮质出现大片坏死,缺血半暗带出现细胞水肿及炎性浸润,各治疗组缺血范围较模型组缩小,缺血半暗带细胞形态结构有所改善,损伤程度均有所减轻,并出现较多新生血管。3.免疫荧光多重染色结果可见,GFAP与GS共表达分析结果显示,与假手术组相比,模型组、中剂量组脑组织中GFAP与GS共表达明显减少（P＜0.05）;与模型组相比,各治疗组间无显著性差异;各治疗组间两两比较,均无显著性差异。说明通窍活血汤治疗组可以促进GFAP与GS的共表达。GFAP与GLT-1共表达分析结果显示:与假手术组相比,模型组及低剂量组脑组织中GFAP与GLT-1共表达显著减少（P＜0.01）,中剂量、高剂量、丁苯酞脑组织中GFAP与GLT-1表达明显减少（P＜0.05）;与模型组相比,高剂量组、丁苯酞组脑组织中GFAP与GLT-1表达明显增多（P＜0.05）;治疗组间两两比较,各治疗组间比较无显著性差异（P＞0.05）。GFAP、GS、20S共表达分析结果显示,与假手术组相比,中剂量组GS、20S、GFAP共表达明显增多（P＜0.05）,模型组、低剂量组、丁苯酞组GS、20S、GFAP的共表达显著增多（P＜0.01）,与模型组相比,中剂量组GS、20S、GFAP共表达明显减少（P＜0.05）;各治疗组间两两比较,与低剂量组、中剂量组相比,高剂量组GS、20S、GFAP共表达显著减少（P＜0.01）,与高剂量组相比,丁苯酞组GS、20S、GFAP表达明显增多（P＜0.05）。4.Western Blotting结果可见,与假手术组相比,模型组GS表达显著降低（P＜0.05）;与模型组相比,各治疗组GS表达明显升高（P＜0.05）,其中,高剂量组GS表达显著升高（P＜0.01）,丁苯酞组GS表达明显升高（P＜0.001）:各治疗组间两两比较,无显著性差异。说明CIRI大鼠缺血脑组织中GS受损,通窍活血汤各组及丁苯酞组可以增强GS表达,以高剂量组和丁苯酞组效果显著。20S的Western Blotting结果显示;与假手术组相比,模型组大鼠缺血侧脑组织中20S表达显著升高（P＜0.01）;与模型组相比,各治疗组20S表达明显降低（P＜0.05）,其中,高剂量组、丁苯酞组20S表达显著降低（P＜0.01）;各治疗组间两两比较,除高剂量组20S表达比低剂量组明显降低外（P＜0.05）,其它治疗组间比较无显著性差异（P＞0.05）。说明通窍活血汤与丁苯酞均可以降低CIRI大鼠缺血脑组织中20S的表达,其中以高剂量组效果最好。5.蛋白羰基化检测结果显示,与假手术组相比,模型组大鼠缺血侧脑组织中总蛋白羰基化水平明显升高（P＜0.05）;与模型组相比,各治疗组总蛋白羰基化水平明显降低（P＜0.05）,其中,高剂量组、丁苯酞组总蛋白羰基化水平显著降低（P＜0.01）。各治疗组之间两两比较无显著性差异（P＞0.05）。见表5,图10。由此可见,CIRI大鼠缺血侧脑组织总蛋白羰基化水平明显升高,通窍活血汤及丁苯酞均能减轻其总蛋白的羰基化水平。各组GS羰基化水平检测结果显示:与假手术组比较,模型组大鼠缺血侧脑组织中GS羰基化水平显著升高（P＜0.001）;与模型组相比,各治疗组GS羰基化水平均显著降低（P＜0.01）;各治疗组间两两比较,无显著性差异（P＞0.05）。说明通窍活血汤与丁苯酞均能够降低CIRI大鼠缺血脑组织中GS的羰基化水平。6.Co IP检测结果显示:与假手术组相比,模型组GS与20S的结合显著增多（P＜0.001）;与模型组比较,各治疗组GS与20S的结合显著减少（P＜0.001）;各治疗组间两两比较,高剂量组GS与20S结合较中剂量组、低剂量组均显著减少（P＜0.01）,其它治疗组间比较无显著性差异（P＞0.05）。结论:CIRI大鼠脑组织GS表达降低,20S表达升高、GLT-1表达降低,经通窍活血汤治疗后,各治疗组大鼠神经功能明显改善,且GS蛋白表达显著升高,20S蛋白表达显著降低,20S与GS的结合减弱,说明通窍活血汤对CIRI的治疗作用可能是通过保护GS蛋白免受20S蛋白酶体的降解,对抗谷氨酸兴奋性毒性以发挥脑保护作用。其中通窍活血汤高剂量组在提高缺血脑组织GS的表达,降低20S与GS的结合,促进星形胶质细胞对Glu的清除,增强GLT-1表达方面优于通窍活血汤其他治疗组及丁苯酞组。