【摘 要】
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根据大肠杆菌O157：H7eaeA基因已发表的核苷酸序列，设计并合成了一对引物P1/P2，扩增eaeA基因完整的开放阅读框架(ORF)，其长度为2805bp。根据该基因的酶切图谱和表达载体多克隆
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根据大肠杆菌O157：H7eaeA基因已发表的核苷酸序列，设计并合成了一对引物P1/P2，扩增eaeA基因完整的开放阅读框架(ORF)，其长度为2805bp。根据该基因的酶切图谱和表达载体多克隆位点，在上、下游引物中加入适当的限制性内切酶位点，构建了原核表达质粒。为得到表达的融合蛋白，设计上游引物时，切除了eaeA基因的起始密码子ATG，并调整eaeA基因和其后载体序列的阅读框的正确。
将广东分离株大肠杆菌O157：H7021210增菌培养后，抽提染色体DNA，利用PCR方法特异性地获得了一条约2800bp的DNA条带，成功扩增出eaeA基因。用T-A克隆方法，将PCR产物与pMD18-T载体连接，成功构建了大肠杆菌eaeA基因重组质粒pMD-eaeA。经PCR鉴定、酶切鉴定和核苷酸序列测定，确证克隆基因为大肠杆菌O157：H7eaeA基因。
重组质粒pMD-eaeA中的eaeA基因经双酶切、连接、转化，亚克隆到原核表达载体pET-28a中，在选择性LB固体培养基上筛选阳性克隆。将经质粒PCR鉴定和双酶切鉴定为阳性的转化子测序作进一步鉴定，成功构建了重组表达质粒pET-eaeA。
本研究对广东分离株EHECO157：H7021210eaeA基因进行了基因克隆和原核表达，获得了较好的表达效果，为更简便的方式获取大量的诊断用抗原和制备基因工程疫苗提供技术积累。
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