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丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）,唇形科鼠尾草属多年生药用草本植物。丹参蕴含着极高的药用价值,其药用部位为根茎,有效成分主要是可用于治疗冠心病、心肌梗塞等心脑血管疾病的丹参酮类和酚酸类次生代谢产物。丹参分布范围广泛,不同地区形态差异明显,种质资源多样性丰富。随着人们对其药理作用的深入研究,它的商业价值逐渐被认识到,市场需求量也不断增加,但是野生资源难以满足市场需求,人工种植已成现有趋势。干旱胁迫是植物经常面临的一种胁迫,在干旱地区种植丹参是缓解其资源短缺问题的重要手段之一。作为类胡萝卜素催化和脱落酸合成的重要酶基因,研究表明类胡萝卜素裂解氧化酶（carotenoid cleavage oxygenases,CCO）基因家族在调控植物抵御逆境胁迫中发挥着重要的作用,可将其作为分子标记用于丹参抗旱品种的选育工作中。因此,本研究基于丹参Sm MYB36在干旱条件下的转录组数据筛选出一条响应干旱胁迫的基因Sm CCD4,根据全基因组数据库对CCO家族基因进行全面的生物信息学分析和表达分析,通过探究过表达Sm CCD4转基因丹参植株响应干旱处理的生理特性及次生代谢产物的积累,为丹参种质选育提供基因特异性分子标记。主要研究内容及结果如下:1.利用本实验室测序完成的丹参基因组数据库,比对筛选获得了26个丹参CCO基因家族成员。对家族成员进行生物信息学分析包括理化性质、系统发育树分析、结构域分析、基因结构、保守基序分析和启动子顺式作用元件分析,发现丹参Sm CCD4与拟南芥At CCD4聚为一支,CCO基因家族不具有统一的蛋白基序,许多与激素、生物和非生物胁迫响应相关的顺式作用元件在Sm CCD4基因的启动子区域被发现;对Sm CCD4蛋白进行疏水性/亲水性预测、跨膜结构域预测、信号肽预测、三级结构预测,发现Sm CCD4蛋白亲疏水能力不明确,也不具有信号肽和跨膜结构域;分析不同组织部位及不同胁迫处理下Sm CCD4基因的表达模式,结果显示Sm CCD4基因响应脱落酸和聚乙二醇处理。初步掌握了CCO基因家族的结构和功能特征,推测CCO基因家族广泛参与了丹参的各项生命过程,并且参与丹参的抗旱分子途径。2.设计克隆引物扩增得到Sm CCD4基因的c DNA序列,全长1101 bp,编码367个氨基酸。进一步利用Gateway技术构建Sm CCD4-p Earley Gate202过表达载体,通过农杆菌浸染的叶盘转化法得到过表达Sm CCD4的转基因株系。DNA和RNA分子水平验证后获得Sm CCD4基因的8株转基因阳性株系,并选择过表达效率较高的3个株系用于后续实验过程。3.聚乙二醇模拟干旱条件处理丹参组培苗观察到过表达株系的生长状况;对干旱处理的丹参植株进行检测,发现与野生型相比,过表达株系中的SOD含量有2.5倍的显著升高;MDA含量有0.5倍的显著性降低;H2O2含量也有0.2倍的显著性降低,另外Sm CCD4过表达株系中的ABA含量有显著提高,显示过表达Sm CCD4的丹参与野生型植株相比,表现出更好的抗旱功能。4.对已有的Sm CCD4过表达转基因株系中丹酚酸类和丹参酮类物质的含量进行测定,结果显示丹参Sm CCD4过表达株系OE-Sm CCD4-4和OE-Sm CCD4-7中迷迭香酸含量分别比对照增加了1.4和1.5倍;OE-Sm CCD4-4,OE-Sm CCD4-6和OE-Sm CCD4-7中丹参酮Ⅰ含量与对照组相比分别增加了2.8,3.5和1.9倍;OE-Sm CCD4-4、OE-Sm CCD4-6和OE-Sm CCD4-7中丹参酮ⅡA含量与对照组相比分别增加了6.0,5.0和3.0倍;OE-Sm CCD4-4、OE-Sm CCD4-6和OE-Sm CCD4-7中隐丹参酮含量与对照组相比分别增加了1.6,2.5和1.4倍;OE-Sm CCD4-4,OE-Sm CCD4-6和OE-Sm CCD4-7中二氢丹参酮含量与对照组相比分别增加了5.9,5.9和3.5倍,说明丹参Sm CCD4基因可以使次生代谢产物的积累增加。5.对丹参Sm CCD4转基因株系中丹酚酸以及丹参酮合成通路上的关键酶基因进行表达量的测定。定量结果显示,在丹参Sm CCD4过表达株系OE-Sm CCD4-4、OE-Sm CCD4-6和OE-Sm CCD4-7中,丹参酮合成途径上的酶基因Sm CPS1、Sm DXS1、Sm GPPS、Sm HMGR1在丹参Sm CCD4过表达转基因株系中普遍具有上调的趋势,表明Sm CCD4对丹参酮类物质合成途径上的大部分酶基因起到促进作用,从而增加丹参酮类物质的积累;丹酚酸合成途径上的酶基因Sm PAL1、Sm C4H1、Sm4CL1,Sm TAT1、Sm HPPR,Sm RAS、Sm CYP98A14与对照株系相比表达量也有显著变化,说明丹参Sm CCD4基因通过调控代谢合成通路上的重要酶基因的表达来影响次生代谢产物的合成积累。综上所述,本研究通过对丹参CCO家族成员的系统分析,为研究丹参Sm CCD4基因功能奠定了基础。并通过获得过表达株系,检测指标初步明确基因Sm CCD4能够通过调控代谢合成通路上的重要酶基因的表达使丹参酮类物质的积累增加,并且可以提高抗氧化酶的活性使植物氧化程度降低以减轻逆境对植物的损伤程度,可将Sm CCD4作为丹参抗旱种质选育的分子标记。