背景与目的:据GLOBOCAN统计,消化道癌发病率和死亡率始终居于高位,并且肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）、胃癌（Gastric cancer,GC）、结直肠癌（Colorectal carcinoma,CRC）始终位于我国发病率和死亡率排名前5的癌症行列。消化道癌症发病的诱因多,发病机制也涉及不同的基因表达及多种信号通路的变化。消化道癌症早期不易被诊断,导致多数患者错失了最佳手术治疗时间,所以,化疗是消化道癌手术和非手术病人几乎绕不开的治疗手段。目前,消化癌症化疗药物名目繁多,但绝大多数药物无靶向性或靶向性较弱,导致药物副作用强大且疗效不佳,而且几乎所有化疗药物使用后很快出现多药耐药现象（Multidrug resistance,MDR）,从而更使消化道癌治疗预后差。HCC是消化道癌里目前治疗效果最差、进展最快的类型,其化疗发生MDR的现象普遍,通常采用联合用药的方式减缓MDR对HCC患者预后的影响,但不能显著抑制MDR。因此,除HCC靶向药物研发外,针对HCC化疗的MDR是HCC临床治疗研究的重点之一。肿瘤生物信息学是利用数理统计方法揭示肿瘤数据中生物数据意义的学科,能广泛的应用于生物学、医学、药学等研究领域,并极大地促进了精准医疗的发展。癌症的发生发展是由基因突变长期积累加表观遗传变异引起的。利用生物信息学方法分析基因表达变化和患者的临床信息,可以筛选到癌症发生发展相关的重要基因,为肿瘤药物的研发提供新的靶点。分析多个基因间的相互作用关系,可以构建基因表达互作网络,并发现高连接度的核心基因（hub基因）。并且可以根据基因组合表达情况与患者生存状况的相关性对肿瘤恶性进行评估,及时调整肿瘤治疗方案。此外,近年来发展了很多新的在线肿瘤数据库,促进了基因结构与功能、药物靶点及机制、以及代谢与疾病相关性等多方面的研究,这利于肿瘤内在机制的揭示,从而为患者的治疗提供更有利的策略。本研究基于上述情况选择HCC进行生物信息学分析,利用HCC耐药数据,期望筛选出与HCC MDR关键基因表达调节相关的hub基因。并构建生存模型以期望为HCC早期诊断、病程及疗效评估提供新的思路。最后通过包括基因突变分析、免疫浸润分析等在内的多组学分析,探索HCC MDR hub基因的潜在作用及机制。并通过实验初步探索本研究发现的HCC MDR hub基因之一TRIM9（tripartite motif containing 9,RNF91、SPRING）的功能,以期望为抑制HCC MDR提供新的靶向位点。方法:1.TCGA数据分析6个与化疗耐药相关基因（Rgnef、Apex1、ITGB1、STX1A、CK2、Ep CAM）在HCC、GC、CRC的表达情况,并通过反转录RT-PCR实验进行验证。利用Cell Miner数据库分析6个基因与IC50的相关性,通过GEPIA2数据库进行基因生存期分析;2.基于GEO数据库进行差异基因表达分析,以获得HCC耐药细胞系及野生型细胞系的差异基因,并通过GO功能富集分析、KEGG通路富集分析和GSEA分析探索与HCC MDR发生相关的生物学过程;3.基于TCGA数据,进行ss GSEA分析及COX比例风险回归分析,探索与HCC患者预后相关的主要生物学过程;4.基于加权基因共表达网络分析方法筛选HCC MDR相关基因,并结合差异基因表达分析结果确定hub基因;5.通过LASSO-COX回归分析鉴定与HCC预后相关的MDR hub基因,并进行生存模型及Nomogram的构建与验证;6.利用HCC外显子测序数据,基于肿瘤突变负荷分析,判断预后风险评分与肿瘤突变相关性,并利用CIBERSOFT算法推断耐药数据集和TCGA-LIHC数据中的免疫细胞类型;7.基于R包multi Mi R和star Base数据库、Circ Net数据库及Circular RNA Interactome数据库分析预测HCC MDR hub基因的mi RNA、lnc RNA以及circ RNA,并结合非编码RNA的差异表达分析,挖掘HCC MDR hub基因潜在的分子机制;8.最后,选择HCC MDR hub基因中与HCC预后关系最密切的TRIM9,构建并合成其sh RNA表达载体,转染后TRIM9基因被敲低70%以上,通过MTT、流式细胞仪、划痕等实验检测TRIM9敲低后Hep G2/ADR细胞某些恶性表型的变化。结果:1.数据分析及实验结果表明化疗耐药相关基因在HCC、GC、CRC中表达量多数显著上调,并且基因表达量多数与患者预后差相关;2.生物信息学分析和筛选的HCC MDR相关的差异基因（400多个）主要富集在细胞外基质、细胞周期等多个相关生物学过程中。其中,细胞周期和凋亡相关调控过程是影响患者预后的主要风险因素;3.共筛选到66个HCC MDR相关的hub基因,其中共有31个基因显著上调,35个基因显著下调,并且发现多数基因与细胞周期和细胞凋亡相关过程也高度相关;4.基因相互作用网络分析进一步筛选到16个HCC MDR hub基因,并发现多数MDR hub基因与MDR关键基因（ABCB1、ABCG2、ABCC5）显著相关;5.以LASSO-COX回归分析法进一步获得了5个HCC MDR hub基因（ABCB6、FLNC、MCC、NAV3和TRIM9）,以此构建了可以作为独立预后因素的生存模型,并结合临床信息建立了Nomogram图,且评估效果较好;6.以特殊方法（见方法6）对上述5个基因分析发现它们的表达量与HCC突变负荷相关,并且与免疫逃逸相关;7.预测了靶向HCC MDR hub基因的mi RNA/lnc RNA/circ RNA,并筛选了ce RNA网络,发现靶向TRIM9的lnc RNA与MDR相关。并且TRIM9与患者预后及药物敏感性显著相关;8.TRIM9敲低后,Hep G2/ADR细胞增殖率显著降低,Hep G2/ADR细胞凋亡加强,并且有效抑制了Hep G2/ADR细胞的迁移能力。总结与结论:1.发现6个与化疗耐药相关基因（Rgnef、Apex1、ITGB1、STX1A、CK2、Ep CAM）在消化道肿瘤表达水平的组合分析能准确预测患者预后;2.筛选到66个与HCC MDR发生相关的hub基因,它们主要影响细胞周期与凋亡过程,为HCC MDR的研究提供了新的研究方向;3.经过对66个与HCC MDR发生相关的hub基因的深入分析,确定了5个与预后密切相关的HCC MDR hub基因（ABCB6、FLNC、MCC、NAV3和TRIM9）,并构建了生存模型,可以用于评估患者预后风险指数;4.确认预后风险指数可作为独立预后因子后,绘制了Nomogram风险图,可作为临床及时调整治疗方案的参考;5.探索了5个与预后密切相关的HCC MDR hub基因与HCC相关的分子机制,据此筛选了ce RNA网络;6.选择其中与患者预后及MDR显著相关基因TRIM9,对其表达敲低的结果证明TRIM9表达促进HCC MDR,从而促进Hep G2/ADR细胞增殖、抑制Hep G2/ADR细胞凋亡、强化Hep G2/ADR细胞迁移能力。故此认为TRIM9可以作为抑制HCC MDR形成的靶点,但该基因的具体功能还有待深入分析。