马尾松PmSUSs基因的鉴定及功能分析

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马尾松(Pinus massoniana Lamb.)是中国南方最广泛的针叶树之一,占南方各省森林蓄积量一半以上,其适应性强、生长快、分布广,是重要用材林树种。植物蔗糖代谢不仅参与生长发育,还响应多种非生物逆境胁迫,探讨蔗糖代谢对逆境胁迫的应答机制,对提高植物抗逆性具有重要意义,但迄今少见马尾松蔗糖代谢相关基因的报道。本文鉴定到12个蔗糖代谢相关基因,并对基因的表达进行分析验证;从中筛选出两个蔗糖合酶基因PmSUS1和PmSUS2,分析其不同非生物胁迫下的表达情况,并遗传转化烟草和拟南芥验证功能,主要研究结果如下:1.马尾松蔗糖代谢相关基因的鉴定通过对马尾松高、低脂种质转录组测序结果的分析,鉴定出SUS、INV、SPS三类共12个蔗糖代谢相关基因,通过表达分析验证其表达量与转录组基本一致。2.马尾松蔗糖合酶基因的克隆以转录组序列为模板设计引物,克隆了两个马尾松蔗糖合酶基因的ORF全长,命名为PmSUS1和PmSUS2,ORF序列分别为2,454 bp和2,460 bp,分别编码817和819个氨基酸,编码产物都含有典型的蔗糖合酶(sucrose synthase,PLN00142)保守结构域;分别预测分子量93.21 k D和93.79 k D,理论等电点p I分别为6.02和6.04;系统进化分析表明,PmSUS1和PmSUS2与火炬松SUS蛋白同源性最高,亲缘关系最近。3.PmSUS1和PmSUS2对非生物胁迫的应答利用qPCR技术分析PmSUS1、PmSUS2基因在不同非生物胁迫下的表达。在低温、干旱胁迫下两基因都上调表达,在低温胁迫过程中从0h~48h表达量都呈上升趋势,48h时最高。干旱胁迫中,重度干旱的表达量是对照1.29~1.56倍。在茉莉酸甲酯和机械损伤胁迫下PmSUS1、PmSUS2表达模式不同,茉莉酸甲酯处理下PmSUS1表达水平先上升后下降,PmSUS2为上升下降再上升。4.PmSUS1和PmSUS2基因的遗传转化分别构建了PmSUS1、PmSUS2基因超表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法和花序浸染法将两基因转化烟草和拟南芥。经过筛选与分子检测,成功鉴定到PmSUS1、PmSUS2转基因烟草株系各8株,PmSUS1、PmSUS2转基因拟南芥株系各4株。转基因烟草q PCR检测结果表明:PmSUS1在8个转基因烟草株系中6号株系表达量最高,2号株系最低;PmSUS2在其8个转基因烟草株系中,2号株系表达量最高,7号株系最低。5.转PmSUS1和PmSUS2基因对烟草含糖量的影响通过对PmSUS1、PmSUS2转基因烟草表达量各自最高的3个株系及野生型进行糖含量测定,得到PmSUS1转基因烟草的蔗糖和可溶性糖含量都小于野生型烟草,而PmSUS2转基因烟草蔗糖和可溶性糖含量都大于野生型。6.转PmSUS1和PmSUS2基因提高拟南芥抗逆性对拟南芥PmSUS2转基因株系进行抗逆性研究,得到低温和干旱胁迫下转基因抗氧化酶活性、蔗糖含量、可溶性糖含量均上升,丙二醛(MDA)含量较野生型低,综合推测PmSUS2基因的过表达提高了拟南芥抗逆性。本研究结果为深入研究蔗糖合酶在马尾松中的功能奠定了基础。
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