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河套蜜瓜是内蒙古西部地区的名优特产,目前正在进行产业化开发,但每年因病害的严重发生而造成重大损失.传统的喷施农药和常规育种技术,均未能解决这一严重的问题.随着生物技术的发展,植物抗病基因工程手段给河套蜜瓜抗病育种带来了新的契机.Rs-AFP2(Raphanus Sativus L. antifungal-protein2是从萝卜种子中分离到的一种抗真菌蛋白.它分子量小、稳定性强、生物能耗低、抗菌谱较宽、抗菌活性很强,且不易使病原菌产生抗性;它是植物防御体系中重要的组成部分.在国外Rs-AFP2基因已经被克隆并导入烟草等植物,表达了很高的抗真菌活性.当将Rs-AFP2的V39换成R39后,Rs-AFP2(R39)的抗真菌活性还可进一步提高.该研究对Rs-AFP2基因进行改造设计,进而合成了Rs-AFP2(R39)基因序列.在此基础上建立了以pC18为克隆载体、pBin438为植物表达载体、根癌农杆菌LBA4404为介导载体的河套蜜瓜遗传转化体系.同时建立了河套蜜瓜高效再生组织培养体系.进而将Rs-AFP2(R39)基因导入河套蜜瓜基因组,获得了抗白粉病能力有所提高的转基因植株.河套蜜瓜高效再生体系研究部分.通过直接不定芽发生途径建立高效再生体系.试验对组织培养主要影响因子进行研究和优化,结果如下:子叶外植体最佳日龄为4日龄;外植体最佳取样部位为子叶近轴端1/3切段;接种方式为子叶切块远轴面接触培养基;再生芽分化培养基为MS附加6-BA0.9mg/L;再生芽伸长培养基为MS附加6-BA0.3mg/L;再生芽生根培养基为MS附加IAA1.5mg/L.以此优化体系对河套蜜瓜进行再生培养,外植体再生率达到85﹪以上,单个外植体萌发伸长芽数达到8个以上,再生芽生根成苗率达到95﹪以上.形态学和组织解剖学观察结果表明,该研究获得的再生芽属于直接发生型;子叶外植体上再生芽发生部位具有明显的极性现象;这种极性现象的发生与子叶内组织结构的不对称性和维管束对营养的极性运输有关.该研究还成功诱导出直接发生和间接发生两种类型的体细胞胚,进而获得了再生植株.对体胚再生培养的几个关键影响因子的研究结果如下:体胚诱导培养基以MS附加2,4-D2.0mg/L+6-BA1.0mg/L为最佳浓度配比.体胚诱导培养期内,先进行2周黑暗培养再进行1周见光培养效果较好.培养基糖源浓度以60g/L较适合体细胞胚的发生和发育.解剖学观察结果表明,该研究获得的体细胞胚为单细胞起源,分化进程与合子胚相似.但不同外植体、同一外植体不同部位体细胞胚分化进程存在着明显的不一致性.目的基因合成和载体构建部分.参照Rs-AFP2 cDNA序列和前人经验,设计改造Rs-AFP2基因;以PCR扩增二次延伸法合成了Rs-AFP2(R39)基因全序列,并将该基因片段插入到pUC18之上,构建了pUAFP2(R39)克隆载体.然后通过二次连接法将Rs-AFP2(R39)基因片段与pBin438连接环化.构建了植物双元表达载体pBinAFP2(R39).最后再通过三亲杂交方法,将pBinAFP2(R39)质粒转入介导载体根癌农杆菌LBA4404菌株之中.河套蜜瓜遗传转化及转化子筛选鉴定部分.用携带有pBinAFP2(R39)质粒的根癌农杆菌LBA4404转化河套蜜瓜,试验对几个影响转化的重要因素进行了优化.结果如下:转化受体子叶的最佳日龄为4日,最佳共培养时间为4日,转化子筛选培养基Kan适合浓度为75mg/L.该研究获得一批Kanr植株,经PCR检测,有两株为阳性.对一株的特征谱带进行回收测序,结果表明,Rs-AFP2(R39)基因已经整合到河套蜜瓜的基因组中.进一步在温室内进行白粉病抗性鉴定,结果转基因株系抗病性有所提高,说明Rs-AFP2(R39)基因在河套蜜瓜中得到表达.