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食管癌是严重危害人类健康的常见消化道恶性肿瘤之一,其发病率在世界上位居恶性肿瘤的第七位,死亡率位于第六位。中国是食管癌的高发区,诊断的食管癌中90％以上是食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)。本研究分为两部分:一,探讨了miR-203如何调控对食管癌肿瘤干细胞自我更新:二,研究食管癌相关基因ECRG1的转录调控机制。
近年来肿瘤干细胞成为了肿瘤研究领域的一个热点。在肿瘤的发生发展过程中,肿瘤干细胞可以自我更新,维持肿瘤的生长。肿瘤干细胞的耐药性强,对放化疗不敏感。正是由于肿瘤干细胞的存在,导致肿瘤病人术后肿瘤的复发和侵袭转移。肿瘤干细胞的特点在于其自我更新和多向分化的潜能,因此,探究肿瘤干细胞的自我更新,无限增殖和多向分化的分子调控机制是十分重要的。
现今在白血病,乳腺癌,脑瘤,前列腺癌,胰腺癌,肝癌中,通过细胞表面分子标记的筛选,都已经分离出肿瘤干细胞。并且验证了只有肿瘤干细胞有自我增殖的能力并形成新的肿瘤这一特点。除此之外,侧群细胞(side population cells,SP细胞)分选也是目前常用的分离和富集肿瘤干细胞的方法之一,已经有多种肿瘤细胞系分离出了SP细胞,这些细胞也同样具有肿瘤干细胞样特性,具有自我更新和增殖的能力。我们实验室前期研究已经证实,在食管癌细胞系中分选出的SP细胞能够富集肿瘤干细胞,并且具有肿瘤干细胞样特性,为本实验研究打下良好的基础。
miRNA(microRNA)是最近新发现的一类长度很短的非编码调控单链小分子RNA,可以在肿瘤的发生发展过程中发挥抑癌或者促癌基因的作用。随着研究的深入,现在研究者逐渐开始将目光转向miRNA调控肿瘤干细胞的研究。miRNA-203是一个首先在皮肤细胞中鉴定出来的小分子,但随后人们发现在食管癌组织中,miRNA-203的表达量明显下降,显著区别与食管正常组织,说明miRNA-203在食管癌变过程中起着重要的作用。
本研究通过SP细胞分选,得到了富集肿瘤干细胞的亚群SP细胞,miR-203在SP亚群的表达显著低于NSP(none-SP cells)细胞亚群,而干细胞自我更新相关基因Bmi-1表达与miR-203相反。我们通过慢病毒转染食管癌细胞系EC9706的方法,得到了稳定高表达mir-203的细胞株Lenti-miR-203。我们通过预测发现Bmi-1可能是miR-203的下游的靶基因。通过Western Blot验证,与对照相比Bmi-1在Lenti-miR-203细胞株中表达明显下降；在EC9706细胞中转染化学合成的miR-203后,也得到相似的结果；在双荧光素报告基因实验中,将构建的Bmi-1的3’UTR荧光报告质粒转染至Lenti-miR-203细胞株中后,荧光活性显著下降,而将构建的Bmi-1的3’UTR结合位点突变质粒转染后,荧光活性得到一定的恢复。以上两个实验验证了miR-203通过Bmi-1的3’UTR来调控:Bmi-1的表达,Bmi-1确实是miR-203的一个靶基因。
Bmi-1是维持干细胞自我更新能力的重要基因。在肿瘤干细胞SP向NSP细胞分化的过程中,我们通过Western Blot检测到Bmi-1在蛋白水平随着分化程度的增高而表达量逐渐下降,说明在肿瘤干细胞中,Bmi-1也起到关键的调控作用。在随后的实验中,我们发现,与对照组相比,Lenti-miR-203细胞株体外成克隆能力显著下降,对化疗药物的敏感性增加,裸鼠体内的致瘤能力明显减弱。将miR-203高表达细胞株做SP流式检测,发现其SP细胞的比例明显下降。
以上实验说明miR-203及其靶基因Bmi-1在肿瘤干细胞调控中起到重要作用,miR-203可能通过Bmi-1来调控食管癌肿瘤干细胞的自我更新。miR-203能够在内外抑制肿瘤细胞的生长,抑制肿瘤干细胞的自我更新,为食管癌的治疗提供新的策略和理论依据。
食管癌相关基因1(Esophageal Cancer Related Gene1,ECRG1)是我实验室克隆出的新的食管癌相关基因。以往的研究结果表明,ECRG1在体内外可以抑制肿瘤细胞的生长,在食管癌组织中低表达,提示它可能在食管癌的发生发展中起着重要的作用。
为了探讨ECRG1的转录调控机制,我们用5’端缺失突变法对ECRG1的启动子进行了分析,并确定了-463～+167bp是其核心启动子区域。我们在ECRG1的核心启动子发现两个TGF-β通路下游信号分子Smad蛋白转录因子结合位点。通过EMSA和ChIP实验,我们发现Smad5蛋白可以在体内外与ECRG1的核心启动子结合。Realtime PCR实验证明TGF-β处理可以上调ECRG1的表达。在EC9706细胞中,敲降Smad5蛋白水平,我们发现,在随后的TGF-β处理实验中,随诱导时间的增加,和对照组一样,两组细胞的ECRG1表达都逐渐增强,但Smad5敲降组的ECRG1表达量相对于对照组显著下降。
从以上的结果,我们得出结论,TGF-β信号转导通路可以通过下游蛋白Smad5与ECRG1启动子的转录因子结合位点相互作用,从而上调ECRG1的表达。