目的肺癌是世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,并居我国恶性肿瘤死亡率首位,其中肺腺癌是肺癌最常见的病理类型。免疫治疗继靶向治疗后已成为当前肺癌治疗的最新热点。免疫治疗相关蛋白PD-1(programmed cell death-1,程序性死亡受体1)与PD-L1(programmed cell death-ligand 1,程序性死亡配体1)是目前研究的热点蛋白之一,但其表达规律特点及其与靶向治疗相关驱动基因EGFR等状态之间的相关性尚无明确的结论。本文拟以109例浸润性肺腺癌手术标本为对象,以肺腺癌中PD-1、PD-L1蛋白表达的情况为切入点,以免疫组化和彩色图像定量分析技术为基本方法,通过系统研究和分析二者表达规律及其相互间存在的相关性。并对比分析两种EGFR突变状态下肺腺癌的PD-1、PD-L1表达与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤组织分型、临床分期、是否淋巴结转移等临床病理参数的相关性,初步探讨和揭示EGFR通路与PD-1/PD-L1通路的内在联系,旨在为靶向治疗与免疫治疗的临床应用提供前期的理论依据。内容1、研究肺腺癌中,PD-1及PD-L1蛋白表达的情况,并分析二者表达之间存在的相关性。2、研究PD-1、PD-L1分别与性别、年龄、肿瘤组织分型、临床分期、是否淋巴结转移的相关性。3、研究PD-1、PD-L1分别与肺腺癌常见驱动基因EGFR、BRAF、ALK的突变状态的相关性,并主要分析不同EGFR突变状态下PD-1、PD-L1的表达与临床病理参数之间的相关性,对使用靶向药的人群及潜在的免疫治疗对象进行分子分型,为免疫治疗相关的临床研究做出前期工作。4、利用图像分析技术定量研究PD-L1蛋白表达情况及与临床病理参数之间的相关性,并对比PD-L1免疫组化彩色图像定量分析结果与人工判读结果的一致性。材料与方法病例信息选取中日友好医院2010年8月~2016年1月期间送检的109例浸润性肺腺癌手术标本。其中男性51例,女性58例,年龄范围41~81,平均年龄62.2岁,中位年龄62岁。egfr基因突变状态:野生型51例,突变型58例。组织学分型:腺泡为主型腺癌57例;实体为主型腺癌25例;附壁为主型腺癌14例;乳头为主型腺癌11例;微乳头为主型腺癌2例。其中含实体成分的44例;含有微乳头成分的30例;已发生淋巴结转移的34例。肿瘤最大径范围为0.4~10cm,中位数为2.5cm。tnm分期情况:ia期43例;ib期15例;iia期14例;iib期5例;iiia期22例;iiib期2例;iv期8例。检测方法与结果判定1、免疫组化(immunohistochemistry,ihc)染色采用envision两步法,pd-1鼠单抗、pd-l1兔单抗、酶标羊抗小鼠/兔igg聚合物均购自北京中杉金桥生物技术有限公司;dab显色试剂盒购自丹麦dako公司。对免疫组化结果的判定分为两部分:染色强度及阳性细胞百分比。染色强度的划分方法:无着色记0分,淡黄色记1分,棕黄色记2分,棕褐色记3分。阳性细胞百分比≤10%时记1分,10%<阳性细胞百分比≤50%时记2分,阳性细胞百分比>50%时记3分。对pd-1/pd-l1的表达评估采用半定量法,即用染色强度×阳性细胞百分比得分,当该得分≥3时判读为阳性,<3时判读为阴性。2、肺腺癌驱动基因egfr、braf和alk的突变检测采用real-timepcr法中的扩增阻滞突变系统(amplificationrefractorymutationsystem,arms)法,提取试剂盒购自德国凯杰公司,突变检测试剂盒购自厦门艾德生物科技股份有限公司。突变检测的结果判读参考试剂盒说明书。3、对pd-l1蛋白的含量与分布的定量检测采用ihc切片图像分析技术。先用显微镜在低倍镜下扫描全部肿瘤区域,观察pd-l1的表达情况,再随机选取5个高倍视野(×200)进行图像采集。采集的图像使用真彩色病理图像分析系统4.0版进行图像分析,分析的内容包括显示pd-l1表达的棕色区域的面密度、平均光密度以及显示肿瘤细胞核的蓝色区域的面密度。计算每个病例的[棕色区域面密度×平均光密度/蓝色区域面密度],可以得出一个染色程度比值,将该值≥0.05的病例定义为pd-l1蛋白表达图像分析结果阳性。统计学分析应用sas9.1软件进行统计学分析。pd-1与pd-l1的表达的相关性分析采用χ2检验,pd-1、pd-l1的表达与临床病理参数的相关性分析采用χ2检验。pd-1、pd-l1的表达与肺腺癌驱动基因突变状态的相关性分析采用χ2检验。pd-l1图像分析的染色程度比值在不同临床病理参数下的差异性检验采用kruskal-wallis秩和检验。pd-l1蛋白表达图像分析的定性结果与临床病理参数的相关性分析采用χ2检验。免疫组化人工判读和图像分析结果的一致性使用kappa检验。结果1、pd-1/pd-l1在肺腺癌中的表达及二者之间的相关性免疫组化结果显示,pd-1蛋白表达阳性率为68.807%(75/109),pd-l1蛋白表达阳性率为27.523%(30/109)。pd-1与pd-l1表达的相关性具有统计学意义(p<0.05)。在51例egfr基因野生型的肺腺癌中pd-1和pd-l1的阳性率均较高(74.510%,39.216%),二者之间表达的相关性具有统计学意义(p<0.05)。在egfr基因突变型的58例肺腺癌中,pd-1阳性率为63.793%,而pd-l1阳性率仅为17.241%,二者之间表达的相关性不具有统计学意义(p>0.05)。2、肺腺癌中常见驱动基因egfr、braf、alk的状态109例肺腺癌中,egfr基因野生型51例,突变型58例。egfr基因突变包括19-del突变22例,19-del合并t790m突变1例,l858r突变27例,l858r合并s768i突变1例,g719x突变2例,s768i突变2例,g719x合并s768i突变1例,l861q突变1例,20-ins突变1例。braf基因的突变率为1.835%(2/109)。alk融合基因阳性率为3.670%(4/109),在egfr野生型病例中的阳性率为7.843%。3、肺腺癌中pd-1/pd-l1表达与临床病理特征的关系pd-1的表达与较大的年龄以及不含有微乳头成分相关。pd-l1的表达与较大的肿瘤最大径、已发生淋巴结转移、含有实体成分及组织学分型的不同具有相关性。不同组织学分型中pd-l1表达率从高到低依次为微乳头为主型、实体为主型、腺泡为主型、乳头为主型、附壁为主型。虽然pd-l1的表达和临床分期的相关性未具有统计学意义(p=0.08),但统计结果显示,临床分期越晚,其pd-l1表达的阳性率呈增高趋势:Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期及Ⅳ期的pd-l1阳性率分别为18.966%、31.579%、40.625%。在不同egfr状态下,pd-1、pd-l1的表达与各项临床病理参数之间的相关性结果未见明显差别。4、肺腺癌中pd-1/pd-l1表达与egfr、braf、alk基因状态的相关性pd-1与egfr、braf、alk基因状态的相关性均无统计学意义。pd-l1仅与egfr状态相关,与braf、alk基因状态无相关性。egfr野生型肺腺癌患者的pd-l1表达率(39.216%)明显高于egfr突变型患者(17.241%),具有统计学意义(p<0.05)。5、pd-l1免疫组化的图像分析及与人工判读结果的对比分析pd-l1的[棕色区域面密度×平均光密度/蓝色区域面密度]值在不同性别中具有差异性(p<0.05)。pd-l1蛋白表达的定性结果与肿瘤的组织学分型相关(p<0.05)。pd-l1免疫组化图像分析的定性结果与人工判读结果的一致率为88.073%。1、不同egfr状态下,pd-1与pd-l1表达相关性的统计学意义有所不同。egfr野生型的肺腺癌中pd-1和pd-l1阳性率均高于egfr突变型的肺腺癌(p<0.05)。在结果EGFR野生型的肺腺癌中,PD-1与PD-L1表达具有相关性(P<0.05);而在EGFR突变型的肺腺癌中,PD-1与PD-L1表达的相关性不具有统计学意义(P>0.05)。2、PD-1的表达与年龄、是否含有微乳头成分的相关性具有统计学意义(P<0.05)。较大的年龄与组织学分型中不含微乳头成分与PD-1表达阳性相关。3、PD-L1阳性表达与组织学分型、肿瘤大小、是否发生淋巴结转移、是否含有实体成分及EGFR状态的相关性具有统计学意义(P<0.05)。不同组织学分型中PD-L1表达率从高到低依次为微乳头为主型、实体为主型、腺泡为主型、乳头为主型、附壁为主型。较大的肿瘤最大径、已发生淋巴结转移、含有实体成分与PD-L1表达阳性相关。4、采用计算染色程度比值的方法对肺腺癌PD-L1免疫组化彩色图像进行分析的结果和人工判读结果具有良好的一致性(一致率达88.073%,K=0.7157),基于其表达与肿瘤的组织学分型更具有显著相关性(P<0.05),并与性别可能相关(P=0.0573),同时,其染色程度比值的升高与其它临床病理参数(特别是对实体为主型腺癌更差的临床预后)具有一定相关性,提示采用定量检测结果用于评价PD-L1蛋白表达情况可能更具有临床和客观意义。