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结肠是哺乳动物消化系统的重要组成部分，也是水分、无机盐和维生素等营养物质吸收的重要场所。结肠微生物菌群的动态平衡对维护机体营养代谢和吸收至关重要。体内外多种因素可对结肠内微生物菌群动态平衡产生影响。本研究通过在饮水中添加不同剂量氟化钠建立氟暴露小鼠模型。在实验处理第70天，采集小鼠结肠内容物及结肠组织，采用16S rRNA高通量测序、BrdU标记、HE染色、PAS染色、AB-PAS染色、Real-time PCR、Western-blot、气相色谱-质谱联用技术，从结肠组织病理形态学、细胞生物学、微生物学及脂肪酸代谢等角度研究了氟致小鼠结肠微生物菌群失调的分子机制，为氟中毒的研究提供新的思路。具体结果如下：
1.氟暴露损伤小鼠结肠组织形态结构，改变其微环境
HE染色结果显示，在氟暴露后小鼠结肠肠腺深度下降，结肠上皮细胞数目减少，结肠肌层厚度变薄；扫描电镜观察发现，对照组小鼠结肠管腔黏膜充实、排列紧密有序，而氟暴露组小鼠结肠黏膜萎缩、塌陷甚至脱落；透射电镜下，对照组小鼠结肠上皮细胞表面微绒毛完整，细胞紧密排列，线粒体丰富、形态正常，而氟暴露组小鼠结肠上皮细胞绒毛断裂、排列紊乱，黏膜细胞线粒体嵴断裂甚至空泡化。以上结果提示，过量氟严重损伤了小鼠结肠组织和细胞结构。AB-PAS和PAS染色进一步证实，氟显著降低了结肠杯状细胞数，抑制了糖蛋白的分泌，可见氟暴露损伤了小鼠结肠组织形态学结构并改变了其微环境。
2.氟暴露通过干扰JAK/STAT通路抑制小鼠结肠上皮细胞增殖
经Real-time PCR检测发现，氟暴露组小鼠结肠内TLR4和ERK1/2mRNA表达水平均显著上升（P＜0.01），且与氟暴露呈现剂量依赖性；NF-κB mRNA表达水平在氟25和氟50组均显著升高（P＜0.01），而IL-6的mRNA表达在氟暴露组则显著下降，且与氟暴露呈现剂量依赖性。免疫荧光和Western-blot检测结果显示，TLR4在氟50和氟100组蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），ERK1/2蛋白表达水平在氟100组显著升高（P＜0.01），NF-κB的蛋白表达水平在氟25和氟50组均显著升高（P＜0.01），其蛋白表达趋势与mRNA表达趋势一致，而IL-6的蛋白表达水平在氟处理后则呈下降趋势，尤其在氟50和氟100组，其表达水平与对照组相比差异极显著（P＜0.01）；提示过量的氟诱发了结肠炎症反应。
BrdU标记试验检测结果显示氟暴露抑制了结肠上皮细胞增殖能力，尤其在氟50和氟100组抑制作用极为显著（P＜0.01）。进一步经Real-time PCR检测发现，在氟50和氟100组，小鼠结肠内调控细胞增殖的JAK、STAT3、STAT5、PCNA和Ki67的mRNA表达水平均显著下降（P＜0.01），且与氟暴露剂量呈负相关；而小鼠结肠内CDK4的mRNA表达水平却随着氟暴露剂量的增加而显著上调（P＜0.05,P＜0.01）。Western-blot结果显示，在氟暴露之后，小鼠结肠内的JAK/STAT通路相关蛋白表达变化趋势与mRNA表达水平相一致。以上结果表明氟通过诱导肠道炎症反应和干扰JAK/STAT通路抑制了小鼠结肠上皮细胞的增殖。
3.氟暴露诱导小鼠结肠微生物菌群失调
16S rRNA高通量测序技术检测发现，氟暴露后小鼠结肠微生物的多样性及组成发生了显著改变。LEfSe（LDA Effect Size）分析结果显示丰度差异较大的物种一共有33个（LDA值＞4）。氟暴露处理后，在属水平上不同组间优势菌属的丰度发生显著变化。如：乳酸杆菌属的丰度随氟剂量增加显著上升（P＜0.001），苏黎世杆菌属的丰度也呈现显著上升趋势（P＜0.05）；而双歧杆菌属、Faecalibaculum、norank_f_Erysipelotrichaceae的丰度在氟暴露处理后则呈现下降趋势，尤其在氟100组中双歧杆菌属、Faecalibaculum、norank_f_Erysipelotrichaceae的丰度菌显著下降（P＜0.001）。以上结果表明，过量氟改变了小鼠结肠微生物菌群的丰度及多样性。
4．氟暴露影响小鼠结肠内抗菌肽及其调控蛋白的表达
小鼠结肠抗菌肽表达检测发现，氟暴露后结肠内Cathelicidin相关抗菌肽（Cathelicidin-related antimicrobial peptide，CRAMP）、β-防御素1以及β-防御素3的mRNA表达水平均显著上升。与对照组相比，氟25组小鼠结肠CRAMP、β-防御素-1和β-防御素-3的表达水平分别上升了138%（P＜0.01）、516%（P＜0.01）和36%；氟50组中CRAMP、β-防御素-1以及β-防御素-3的表达水平分别上升了217%（P＜0.01）、555%（P＜0.01）和58%（P＜0.05）；氟100组CRAMP、β-防御素-1以及β-防御素-3的表达水平则分别上升了252%（P＜0.01）、594%（P＜0.01）和72%（P＜0.05）。这提示氟暴露显著上调了小鼠结肠抗菌肽的表达量。
进一步免疫荧光技术检测发现，在氟处理后小鼠结肠内IL-17A、IL-22和IL-22R的蛋白表达量增加，而IL-17RA的表达量下降；与此同时，Western-blot结果显示调控抗菌肽相关基因Myd88的蛋白表达水平在氟25（P＜0.05）和氟50组（P＜0.01）中均显著下调，在氟100组中，虽然小鼠结肠内的Myd88的蛋白表达量有所升高，但仍显著低于对照组（P＜0.05）；IL-1β的蛋白表达水平随着氟剂量的增加显著上升（P＜0.01），且与氟剂量呈剂量依赖关系；而IL-17A的蛋白表达水平加氟之后则呈现上升趋势，且其表达量与氟暴露剂量呈正相关关系，尤其在氟50（P＜0.05）和氟100组（P＜0.01），其蛋白表达水平显著上升。以上结果表明氟暴露可以通过干扰Myd88、IL-1β、IL-17A、IL-17RA、IL-22和IL-22R的表达影响抗菌肽CRAMP、β-防御素1和β-防御素3合成与表达。
5.氟暴露诱导小鼠结肠中短链脂肪酸含量降低
经气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术分析表明，氟暴露对小鼠结肠内容物短链脂肪酸产生显著影响。与对照组相比，氟25、氟50和氟100组丁酸含量分别下降20.78%（P＜0.01）、32.06%（P＜0.01）和52.81%（P＜0.01）；乙酸、戊酸、异戊酸、异丁酸的含量在氟50和100组中呈剂量依赖性显著降低，在氟50组中，乙酸、异丁酸、异戊酸、戊酸的含量分别下降了27.71%（P＜0.05）、42.22%（P＜0.05）、37.83%（P＜0.05）和34.06%（P＜0.05）；在氟100组中，乙酸、异丁酸、异戊酸、戊酸的含量分别下降了32.73%（P＜0.05）、73.76%（P＜0.01）、79.45%（P＜0.01）和52.52%（P＜0.05）；丙酸的含量只在氟100组中显著降低，与对照组相比下降了43.52%（P＜0.01）。这些结果表明长期过量的氟摄入显著降低小鼠结肠内容物中短链脂肪酸含量，这可能与结肠微生物菌群的改变有关。
综上所述，过量的氟摄入通过损伤结肠组织形态学结构、抑制结肠上皮细胞增殖破坏了肠道微生物定植的微环境，并干扰抗菌肽的表达最终引发结肠微生物菌群失调，进而导致短链脂肪酸代谢异常。本研究从微生物定植的肠道内环境、抗菌肽及短链脂肪酸代谢等方面揭示了氟致小鼠结肠微生物菌群失调的分子机制，为氟中毒的研究提供了新的思路。
1.氟暴露损伤小鼠结肠组织形态结构，改变其微环境
HE染色结果显示，在氟暴露后小鼠结肠肠腺深度下降，结肠上皮细胞数目减少，结肠肌层厚度变薄；扫描电镜观察发现，对照组小鼠结肠管腔黏膜充实、排列紧密有序，而氟暴露组小鼠结肠黏膜萎缩、塌陷甚至脱落；透射电镜下，对照组小鼠结肠上皮细胞表面微绒毛完整，细胞紧密排列，线粒体丰富、形态正常，而氟暴露组小鼠结肠上皮细胞绒毛断裂、排列紊乱，黏膜细胞线粒体嵴断裂甚至空泡化。以上结果提示，过量氟严重损伤了小鼠结肠组织和细胞结构。AB-PAS和PAS染色进一步证实，氟显著降低了结肠杯状细胞数，抑制了糖蛋白的分泌，可见氟暴露损伤了小鼠结肠组织形态学结构并改变了其微环境。
2.氟暴露通过干扰JAK/STAT通路抑制小鼠结肠上皮细胞增殖
经Real-time PCR检测发现，氟暴露组小鼠结肠内TLR4和ERK1/2mRNA表达水平均显著上升（P＜0.01），且与氟暴露呈现剂量依赖性；NF-κB mRNA表达水平在氟25和氟50组均显著升高（P＜0.01），而IL-6的mRNA表达在氟暴露组则显著下降，且与氟暴露呈现剂量依赖性。免疫荧光和Western-blot检测结果显示，TLR4在氟50和氟100组蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），ERK1/2蛋白表达水平在氟100组显著升高（P＜0.01），NF-κB的蛋白表达水平在氟25和氟50组均显著升高（P＜0.01），其蛋白表达趋势与mRNA表达趋势一致，而IL-6的蛋白表达水平在氟处理后则呈下降趋势，尤其在氟50和氟100组，其表达水平与对照组相比差异极显著（P＜0.01）；提示过量的氟诱发了结肠炎症反应。
BrdU标记试验检测结果显示氟暴露抑制了结肠上皮细胞增殖能力，尤其在氟50和氟100组抑制作用极为显著（P＜0.01）。进一步经Real-time PCR检测发现，在氟50和氟100组，小鼠结肠内调控细胞增殖的JAK、STAT3、STAT5、PCNA和Ki67的mRNA表达水平均显著下降（P＜0.01），且与氟暴露剂量呈负相关；而小鼠结肠内CDK4的mRNA表达水平却随着氟暴露剂量的增加而显著上调（P＜0.05,P＜0.01）。Western-blot结果显示，在氟暴露之后，小鼠结肠内的JAK/STAT通路相关蛋白表达变化趋势与mRNA表达水平相一致。以上结果表明氟通过诱导肠道炎症反应和干扰JAK/STAT通路抑制了小鼠结肠上皮细胞的增殖。
3.氟暴露诱导小鼠结肠微生物菌群失调
16S rRNA高通量测序技术检测发现，氟暴露后小鼠结肠微生物的多样性及组成发生了显著改变。LEfSe（LDA Effect Size）分析结果显示丰度差异较大的物种一共有33个（LDA值＞4）。氟暴露处理后，在属水平上不同组间优势菌属的丰度发生显著变化。如：乳酸杆菌属的丰度随氟剂量增加显著上升（P＜0.001），苏黎世杆菌属的丰度也呈现显著上升趋势（P＜0.05）；而双歧杆菌属、Faecalibaculum、norank_f_Erysipelotrichaceae的丰度在氟暴露处理后则呈现下降趋势，尤其在氟100组中双歧杆菌属、Faecalibaculum、norank_f_Erysipelotrichaceae的丰度菌显著下降（P＜0.001）。以上结果表明，过量氟改变了小鼠结肠微生物菌群的丰度及多样性。
4．氟暴露影响小鼠结肠内抗菌肽及其调控蛋白的表达
小鼠结肠抗菌肽表达检测发现，氟暴露后结肠内Cathelicidin相关抗菌肽（Cathelicidin-related antimicrobial peptide，CRAMP）、β-防御素1以及β-防御素3的mRNA表达水平均显著上升。与对照组相比，氟25组小鼠结肠CRAMP、β-防御素-1和β-防御素-3的表达水平分别上升了138%（P＜0.01）、516%（P＜0.01）和36%；氟50组中CRAMP、β-防御素-1以及β-防御素-3的表达水平分别上升了217%（P＜0.01）、555%（P＜0.01）和58%（P＜0.05）；氟100组CRAMP、β-防御素-1以及β-防御素-3的表达水平则分别上升了252%（P＜0.01）、594%（P＜0.01）和72%（P＜0.05）。这提示氟暴露显著上调了小鼠结肠抗菌肽的表达量。
进一步免疫荧光技术检测发现，在氟处理后小鼠结肠内IL-17A、IL-22和IL-22R的蛋白表达量增加，而IL-17RA的表达量下降；与此同时，Western-blot结果显示调控抗菌肽相关基因Myd88的蛋白表达水平在氟25（P＜0.05）和氟50组（P＜0.01）中均显著下调，在氟100组中，虽然小鼠结肠内的Myd88的蛋白表达量有所升高，但仍显著低于对照组（P＜0.05）；IL-1β的蛋白表达水平随着氟剂量的增加显著上升（P＜0.01），且与氟剂量呈剂量依赖关系；而IL-17A的蛋白表达水平加氟之后则呈现上升趋势，且其表达量与氟暴露剂量呈正相关关系，尤其在氟50（P＜0.05）和氟100组（P＜0.01），其蛋白表达水平显著上升。以上结果表明氟暴露可以通过干扰Myd88、IL-1β、IL-17A、IL-17RA、IL-22和IL-22R的表达影响抗菌肽CRAMP、β-防御素1和β-防御素3合成与表达。
5.氟暴露诱导小鼠结肠中短链脂肪酸含量降低
经气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术分析表明，氟暴露对小鼠结肠内容物短链脂肪酸产生显著影响。与对照组相比，氟25、氟50和氟100组丁酸含量分别下降20.78%（P＜0.01）、32.06%（P＜0.01）和52.81%（P＜0.01）；乙酸、戊酸、异戊酸、异丁酸的含量在氟50和100组中呈剂量依赖性显著降低，在氟50组中，乙酸、异丁酸、异戊酸、戊酸的含量分别下降了27.71%（P＜0.05）、42.22%（P＜0.05）、37.83%（P＜0.05）和34.06%（P＜0.05）；在氟100组中，乙酸、异丁酸、异戊酸、戊酸的含量分别下降了32.73%（P＜0.05）、73.76%（P＜0.01）、79.45%（P＜0.01）和52.52%（P＜0.05）；丙酸的含量只在氟100组中显著降低，与对照组相比下降了43.52%（P＜0.01）。这些结果表明长期过量的氟摄入显著降低小鼠结肠内容物中短链脂肪酸含量，这可能与结肠微生物菌群的改变有关。
综上所述，过量的氟摄入通过损伤结肠组织形态学结构、抑制结肠上皮细胞增殖破坏了肠道微生物定植的微环境，并干扰抗菌肽的表达最终引发结肠微生物菌群失调，进而导致短链脂肪酸代谢异常。本研究从微生物定植的肠道内环境、抗菌肽及短链脂肪酸代谢等方面揭示了氟致小鼠结肠微生物菌群失调的分子机制，为氟中毒的研究提供了新的思路。