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目的:糖尿病是一类以高血糖为主要特征的慢性全身性代谢性疾病,分为胰岛素分泌缺陷型(I型),胰岛素作用障碍型(II型),或者两者兼有。糖尿病骨病患者涉及多种病原,其中包括遗传因素、环境因素或者后天因素,但是越来越多研究表明高血糖是糖尿病骨病最重要的病原。研究表明,糖尿病骨病中的高血糖破坏成骨功能,如基质形成、矿化等。研究表明Runx2是成骨分化过程中重要的转录调节因子,是多条信号通路的交汇点。PI3K/AKT信号通路是胰岛素信号通路中重要的一部分,调节着糖原合成;Wnt/β-catenin信号通路是经典的成骨通路。目前本课题组研究已经证实,高糖环境下干细胞成骨分化能力减弱,但是具体怎样引起成骨能力的下降目前还不明确。因此,本研究将在体外转染外源性Runx2,从分子生物学方面检测Runx2在高糖环境下对干细胞成骨分化的作用,并从信号通路方面研究其中的调控机制。方法:第一部分:从雄性SD大鼠股骨获取骨髓间充质干细胞,体外培养并通过成骨、成脂以及成软骨诱导分化来鉴定骨髓间充质干细胞。在体外用不同含糖量培养基模拟高糖高渗环境,通过cck-8和流式细胞仪检测不同糖浓度和等渗环境中细胞活性和细胞增殖的变化,同时用alp活性、alp染色和茜素红染色等分子生物学手段检测细胞矿化能力。第二部分:根据前面的研究结果,以25mm糖浓度作为高糖浓度。转染外源性runx2质粒,并用qrt-pcr和westernblot验证质粒转染是否成功。探索runx2在高糖环境中的作用,用alp染色和茜素红染色来检测成骨分化能力,同时用qrt-pcr检测runx2、alp、oc和opnmrna的表达水平。转染外源性runx2质粒后,用westernblot检测信号通路上主要信号分子akt、p-akt、gsk3β、p-gsk3β和β-catenin蛋白表达水平,用免疫荧光检测β-catenin亚细胞定位分布。结果:第一部分:体外分离培养的骨髓间充质干细胞能够进行成脂、成骨及成软骨分化。体外模拟高糖高渗状态,在一定糖浓度范围内(5.5mm-25mm),随着糖浓度升高,细胞增殖能力增强,但是对应的等渗组抑制细胞增殖。成骨诱导培养后,随着糖浓度身高,矿化能力降低,成骨能力降低,但是等渗组成骨矿化能力并没有明显改变。第二部分:转染外源性runx2质粒,westernblot和qrt-pcr验证runx2转染成功并高效表达。转染外源性runx2质粒,成骨相关基因runx2、alp、oc及opnmrna表达显著提高,成骨矿化能力提高。转染外源性Runx2质粒,细胞信号通路主要信号分子p-AKT、p-GSK3β和β-catenin蛋白表达量上调,p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β和β-catenin/β-actin比例增加。应用10uM PI3K/AKT抑制剂LY294002后,p-GSK3β和β-catenin蛋白表达量下调,p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β和β-catenin/β-actin比例下降。免疫荧光结果显示生理糖浓度组β-catenin分布在细胞质和细胞核,高糖环境下β-catenin大部分集聚在细胞质中,转染外源性Runx2质粒促进β-catenin累积入核,大部分分布在细胞核中。结论:1.高糖环境下,骨髓间充质干细胞增殖能力增强,成骨矿化能力减弱。2.转染外源性Runx2质粒减弱了高糖对骨髓间充质干细胞成骨分化的抑制作用。3.PI3K/AKT信号通路是胰岛素信号通路的核心部分,PI3K/AKT通路与经典成骨信号Wnt/β-catenin通路可以经GSK3β产生相互效应,高糖环境可通过PI3K/AKT通路使p-GSK3β降低,抑制Wnt通路中β-catenin表达,使骨髓间充质干细胞成骨能力下降,转染Runx2后可一定程度上逆转这种效应。