亚甲基蓝荧光探针对DNA的分析及其在重金属和百草枯与DNA作用研究中的应用

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脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)是遗传信息的携带者和基因表达的物质基础,在生物体的繁育、遗传和变异等生命过程中起着极为重要的作用。环境中大量有毒有害物质如重金属、有机染料、农药等可通过饮食、呼吸、皮肤接触等途径进入机体,在体内与DNA发生直接或间接的作用,改变DNA结构与构象或引起DNA损伤,从而影响其功能或改变其遗传特性。鉴于DNA重要的生理意义,本论文建立了灵敏测定DNA的亚甲基蓝同步荧光猝灭法,并以亚甲基蓝为分子探针,研究了重金属和百草枯与小牛胸腺DNA(ctDNA)的相互作用。论文主要内容包括以下四个部分: 第一部分:基于DNA对有机染料亚甲基蓝(MB)的荧光猝灭效应,结合同步荧光技术建立了一种灵敏测定DNA的同步荧光猝灭法。在pH=6.5~8.2范围内,DNA对亚甲基蓝在680nm处的荧光猝灭程度与DNA的浓度呈线性关系,对于测定ctDNA、变性ctDNA和鲱鱼精DNA(hsDNA),线性范围分别为0.1~4.0μg mL-1、0.05~3.0μg·mL-1和0.1~3.0μg·mL-1,检测限(S/N=3)分别为41.1、13.2和14.5ng·mL-1。该方法简便快速、试剂毒性较小,用于合成样品中DNA的测定,结果令人满意。 第二部分:应用吸收光谱、荧光光谱和荧光偏振研究了MB与ctDNA的作用方式。当γ<4(γ=[DNAp]/[MB])时,MB的吸收随ctDNA浓度的增加呈明显的减色效应,其荧光被ctDNA明显猝灭;而当γ>6时MB的吸收带发生红移,其荧光偏振明显增大,上述结果表明MB与ctDNA可能存在两类结合,γ较低时(γ<4),MB阳离子易与ctDNA链上带负电荷的磷酸基团以静电相吸的方式结合而堆积在ctDNA双螺旋结构表面;而当γ较高时(γ>6),MB分子与ctDNA碱基间通过π-π相互作用及疏水相互作用而发生嵌插结合。热变性和K4Fe(CN)6荧光猝灭研究表明,MB与ctDNA之间的作用方式随二者浓度比的变化而不同,与吸收光谱和荧光光谱的结果一致。实验获得了静电结合和嵌插结合这两类结合的键合常数K,分别为2.94×105L·mol-1和1.13×106L·mol-1。 第三部分:以MB为分子探针,用吸收光谱和荧光光谱研究了Cd(Ⅱ)、Pb(Ⅱ)和Cr(Ⅲ)三种重金属离子与ctDNA的相互作用。MB分子通过嵌插方式结合到ctDNA双螺旋结构上,其荧光被ctDNA明显猝灭,其吸收光谱呈现减色效应;
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