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七叶皂苷为七叶树科植物七叶树Aesculus chinensis Bge.，浙江七叶树Aesculus chinensis Bge.var.chekiangensis （Hu et Fang）Fang或天师栗Aesculuswilsonii Rehd.的干燥成熟种子中提取的一组含酯键的三萜皂苷，其主要成分按高效液相色谱出峰前后顺序分别为七叶皂苷A、B、C、D。药理学研究表明，七叶皂苷具有抗肿瘤、抗炎、抗渗消肿、抗菌、抑制胃酸分泌等作用，临床上七叶皂苷多以钠盐的形式使用，主要用于术后水肿、静脉炎、痔等疾病的治疗。目前关于七叶皂苷的药代动力学研究由于分析方法的限制，多集中于多组分的混合测定，关于七叶皂苷各个单体组分在人体内的药代动力学研究及其在动物体内的代谢研究尚未见报道。本研究首先建立了同时测定人生物样品中七叶皂苷A、B、C、D四种活性成分的HPLC-MS/MS分析方法。在此基础上，研究了健康男性志愿者多剂量静脉滴注和口服给予七叶皂苷钠后，七叶皂苷A、B、C、D四种活性成分在人体内的药代动力学过程；七叶皂苷A、B、C、D四种活性成分在人体内的血浆蛋白结合率；并对七叶皂苷钠口服或静脉给药后，在大鼠体内的代谢过程进行了研究。本研究对七叶皂苷在人体内的药代动力学过程进行了较为系统的阐述，这为七叶皂苷的临床安全、合理用药提供了依据；利用高分辨质谱对七叶皂苷四种同分异构体代谢的研究，有助于人们对七叶皂苷类药物在体内代谢过程的了解，这对揭示皂苷类复杂天然产物的体内代谢规律具有一定的指导意义。一、七叶皂苷生物样品分析方法的建立本研究首先建立了灵敏、快速、高特异性的同时测定人血浆及尿液样品中七叶皂苷A、B、C、D四种活性成分的HPLC-MS/MS方法。血浆或尿液样品首先经C18固相萃取小柱提取，提取物经Zorbax Extend C18色谱柱分离后进行质谱测定。质谱仪为三重四极杆串联质谱，ESI离子源，采用正离子化方式，在多反应监测（MRM）模式下检测。七叶皂苷A、B、C、D和替米沙坦（内标）用于定量分析的离子反应分别为m/z1131.8m/z807.6和m/z515.2m/z276.1。按照FDA及SFDA的规定，对血浆及尿液样品分析方法进行了完整的方法确证，对LLOQ、线性、专属性、精密度、准确度、回收率、稳定性及基质效应进行了考察，结果显示各个指标均满足相关规定的要求。该分析方法的建立为七叶皂苷主要活性组分在人体药代动力学的研究奠定了基础。二、七叶皂苷在人体内的药代动力学研究在建立了同时测定生物样品中七叶皂苷A、B、C、D四种活性成分的基础上，对七叶皂苷钠多剂量（5.77，11.54，23.08mg）静脉滴注及口服给药（60.00mg）后，七叶皂苷A、B、C、D在健康志愿者体内的药代动力学行为进行了研究。静脉滴注给药后，低、中、高三个剂量组的七叶皂苷A的t1/2分别为3.75、9.32和9.67h，中、高剂量组高于低剂量组，但没有显著差异（p＞0.05）；低、中、高三个剂量组的七叶皂苷A的Cmax分别为46.3、70.5和138.8ng/mL、AUC0-∞分别为331、444、658μg/L*h。Cmax和AUC0-∞与给药剂量呈线性相关（r＞0.83）。以上结果表明，七叶皂苷钠静脉滴注给药后，在5.77-23.08mg的剂量范围内，七叶皂苷A呈线性消除。静脉滴注给药后，低、中、高三个剂量组的七叶皂苷B的t1/2分别为3.30、3.72和7.75h，高剂量组高于低、中剂量组，但没有显著差异（p＞0.05）；低、中、高三个剂量组的七叶皂苷B的Cmax分别为76.5、150.7和241.2ng/mL、AUC0-∞分别为217、442、843μg/L*h。Cmax和AUC0-∞与给药剂量呈线性相关（r＞0.99）。以上结果表明，七叶皂苷钠静脉滴注给药后，在5.77-23.08mg的剂量范围内，七叶皂苷B呈线性消除。静脉滴注给药后，低、中、高三个剂量组的七叶皂苷C的t1/2分别为17.5、15.0和18.2h，三个剂量组之间没有显著差异（p＞0.05）；低、中、高三个剂量组的七叶皂苷C的Cmax分别为65.0、163.2和230.3ng/mL、AUC0-∞分别为861、1813、3962μg/L*h。Cmax和AUC0-∞与给药剂量呈线性相关（r＞0.99）。以上结果表明，七叶皂苷钠静脉滴注给药后，在5.77-23.08mg的剂量范围内，七叶皂苷C呈线性消除。静脉滴注给药后，低、中、高三个剂量组的七叶皂苷D的t1/2分别为7.7、9.3和9.7h，三个剂量组之间没有显著差异（p＞0.05）；低、中、高三个剂量组的七叶皂苷D的Cmax分别为19.8、46.3和70.5ng/mL、AUC0-∞分别为138、331、658μg/L*h。Cmax和AUC0-∞与给药剂量呈线性相关（r＞0.98）。以上结果表明，七叶皂苷钠静脉滴注给药后，在5.77-23.08mg的剂量范围内，七叶皂苷D呈线性消除。静脉滴注给予七叶皂苷钠后，七叶皂苷A、B、C、D四种活性成分在健康受试者体内广泛代谢，A、B、C、D四种主要活性成分经尿液以原形排出的药物分别只占给药剂量的约5%、2%、6%和4%，并且三个剂量组之间没有明显差异（p＞0.05）。口服给予七叶皂苷钠60mg后，七叶皂苷A、B、C、D四种活性成分的血药浓度极低，均低于6ng/mL。就AUC0-t而言，口服给药后，七叶皂苷A的AUC0-t为静脉滴注给药的0.9%，七叶皂苷B的AUC0-t为滴注静脉给药的0.2%；七叶皂苷C的AUC0-t为静脉滴注给药的0.5%；七叶皂苷D的AUC0-t为静脉滴注给药的0.8%。以上结果表明，口服给药后，七叶皂苷在人体内的绝对生物利用度很低，提示静脉滴注可能是提高七叶皂苷治疗效果的一个良好给药途径。三、七叶皂苷人血浆蛋白结合率研究采用平衡透析法，对七叶皂苷A、B、C、D四种活性成分的人血浆蛋白结合率进行研究，通过建立的血浆以及透析液中七叶皂苷A、B、C、D四种活性成分的LC-MS/MS分析方法，测定了不同浓度七叶皂苷A、B、C、D在人血浆中的蛋白结合率。结果表明：经24h达到平衡后，七叶皂苷A、B、C、D与人血浆蛋白结合率很高，平均值均大于90%，且各组分间血浆蛋白结合率无明显差异，表明七叶皂苷A、B、C、D在体内主要以与血浆蛋白结合的形式存在。四、七叶皂苷A、B、C、D的质谱裂解规律研究利用LC-Triple TOF MS的精确分子质量、高分辨率及信息关联采集（IDA）技术，对七叶皂苷四种同分异构体的质谱裂解规律进行分析研究，发现了相关的质谱裂解规律。通过对样品进行梯度洗脱，四种七叶皂苷异构体得到了充分的分离，该液相方法的重现性和稳定性良好。通过ESI-Triple TOF分析各异构体的精确分子量，再采用IDA技术，对其进行二级碎片精确分子量扫描。应用相关的数据处理软件，并结合文献，发现并总结了七叶皂苷四种异构体的质谱裂解规律。结果表明，七叶皂苷A、B之间，C、D之间具有相同的裂解规律。由于R2，R3上的基团不同，造成了七叶皂苷和异七叶皂苷之间的裂解规律略有不同，具有各自的特征离子峰，这些特征碎片可用于区分七叶皂苷和异七叶皂苷，对于皂苷类化合物的分析研究具有重要指导意义五、七叶皂苷大鼠代谢研究本研究利用HPLC-Triple TOF MS质谱仪对七叶皂苷主要活性组分在大鼠体内的代谢产物进行了研究。大鼠给药后分别采集粪便及尿液，样品经过固相萃取处理后，经过液相梯度洗脱，完全分离各种代谢产物后，采用ESI-Triple TOF对其进行分析。通过质量亏损技术（Mass Defect），对粪及尿中的代谢产物进行了研究。结果显示，在大鼠体内，七叶皂苷产生了新的同分异构体，由于七叶皂苷含有较多的羟基，推测可能为酯键重排。同时，在尿液样品中，并未发现七叶皂苷的代谢产物，但是在粪便中，则发现了其糖水解后的代谢产物。结合相关文献，推测该产物是由于肠内菌群对七叶皂苷的代谢所致。