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肌细胞生成素(1myogenin, MyoG)是生肌调节因子(1myogenic regulatory factors, MRFs)家族成员之一,属于bHLH型蛋白。MyoG主要参与调解成肌细胞融合成肌管这一过程,在胚胎发育期的成肌作用不可替代,其异位表达可以促使非肌细胞向肌肉方向分化,并且MyoG基因是MRFs家族中唯一可在所有骨髂肌细胞系中均可表达的基因。目前,对该基因的表达、定位及功能的研究主要集中在小鼠、大鼠、斑马鱼等模式生物上,对羊MyoG生物学活性以及利用MyoG生产转基因动物的研究还未见报道。因此,本研究通过克隆羊MyoG基因,进行体外表达、亚细胞定位、成肌活性检测,为高产肉性能转基因羊生产提供重要参考。主要研究内容如下：1. MyoG基因的克隆及序列分析。利用PCR技术从湖羊基因组DNA中扩增出MyoG基因的三个外显子,再通过重叠延伸PCR将外显子拼接成一段完整ORF,并将其克隆至pMD19-T载体中。酶切及测序结果均表明pMD19-T-MyoG构建正确,MyoG基因ORF正确无误。序列比对结果显示,克隆片段与GenBank上发表的波尔山羊(FJ607135)、牛(NM-001111325)、猪(NM-001012406)、小鼠(NM-031189)的MyoG基因序列的同源性分别为99.26%、97.04%、92.00%、87.70%。蛋白质结构域预测显示,由克隆片段翻译的氨基酸序列具有典型的bHLH结构。说明克隆的MyoG基因正确无误,具有发挥生物学活性的结构基础,可以用于后续研究。2.重组MyoG的表达及其亚细胞定位的研究。构建携带报告基因EGFP的融合蛋白表达载体pEGFP-C1-MyoG,脂质体介导体外转染鼠NIH-3T3细胞、鸡胚成纤维细胞(CEF)、羊胎儿成纤维细胞(GEF)。转染48h后,荧光倒置显微镜下观察绿色荧光在细胞中的分布,分析MyoG蛋白在细胞中的定位情况。同时提取转染细胞总RNA及总蛋白,利用RT-PCR、Western Blot检测融合蛋白在NIH-3T3细胞内的表达。结果显示,RT-PCR、Western Blot均能检测到融合蛋白的表达,MyoG蛋白在不同物种细胞中定位无差异,均位于细胞核中,与生物信息学软件预测结果一致,3. MyoG基因成肌活性研究。将前期克隆的羊MyoG基因CDS插入真核表达载体pcDNA3.0,鉴定正确后,重组载体pcDNA3.0-MyoG体外转染GEF, G418压力筛选18d后获得阳性细胞,扩大培养,间接免疫荧光(IFA)检测结蛋白(Desmin)的表达,然后更换培养基进行分化培养,观察细胞形态的变化。结果IFA能检测到Desmin的表达,分化培养2d细胞发生融合,出现肌管形态,5d后肌管大量出现,证明MyoG基因体外具有成肌活性,能诱导非肌细胞向肌肉分化。4.体内精原干细胞介导生产转基因羊。酶切重组质粒pEGFP-C1-MyoG使其线性化,利用聚乙烯亚胺(PEI)介导,通过随机打点法将目的载体注射入公羊睾丸,体内转染精原干细胞(SSCs)。注射公羊与正常母羊自然交配,生产后代,检测外源基因在F1代基因组中的整合及表达情况。PCR、DNA斑点杂交结果表明,外源基因MyoG、EGFP均己整合到后代基因组中,山羊F1代PCR、DNA点杂交阳性率为25.6%(7/27)；绵羊F1代PCR、DNA点杂交阳性率为17.9%(5/28),Western Blot显示F1代山羊、绵羊各有2头表达外源基因,阳性率分别为7.4%(2/27)、7.1%(2/28)。表明睾丸内注射法可能是一种简单有效的生产转基因动物的方法。