背景与目的:近年来,纳米结构羟基磷灰石(hydroxyapatite,HAp)具有良好的骨诱导性和生物降解性得到广泛认可,因此已广泛用作骨组织工程的支架材料。然而,在修复骨缺损的过程中,HAp在骨缺损腔内的降解过程和降解HAp的分布仍不清楚。铽(terbium,Tb)作为镧系元素之一,具有良好的生物相容性和荧光稳定性,已被广泛用于生物荧光标记。为了直观地研究HAp在骨修复过程中的行为,我们设计了具有同心圆结构(concentric circle structure,CCS)的HAp/Tb-HAp纳米线(nanowires,NWs)膜,分别用Tb-HAp NWs和HAp NWs构建了内圆和外环。HAp/Tb-HAp CCS膜具有良好的成骨能力和高效的荧光可见性。将HAp/Tb-HAp CCS膜植入大鼠颅骨缺损模型中,通过追踪荧光分布来观察HAp在体内骨缺损修复过程中的降解-扩散-重构行为。因此,本研究为观察HAp纳米材料在骨修复过程中的降解-扩散-重构行为提供了一种直观的方法。材料与方法:1.HAp和Tb-HAp NWs膜的合成及性质表征。通过水热法合成HAp NWs和Tb-HAp NWs后抽滤成膜。通过X射线衍射图(X-ray diffraction,XRD)对HAp NWs和Tb-HAp NWs进行X射线衍射分析获取物相分析结果,利用傅里叶变换红外光谱(fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)对HAp NWs和Tb-HAp NWs进行定性分析,在扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)和透射电镜(transmission electron microscope,TEM)下观察HAp NWs和Tb-HAp NWs的形貌及晶格特征,用荧光分光光度计(fluorescence spectrophotometer,FLS)测量Tb-HAp NWs激发光谱和发射光谱,用电子探针微分析仪(electron probe microanalyzer,EPMA)分析Tb的掺杂浓度。2.HAp NWs和Tb-HAp NWs膜生物相容性、成骨分化能力及生物降解的体外检测。2.1.将大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)接种到HAp NWs和Tb-HAp NWs膜上,以空白组织培养板(tissue culture plate,TCP)上接种BMSCs为阴性对照,在SEM下观察细胞形态,进行活死细胞染色,并用CCK8(cell counting kit 8)法检测细胞活性。2.2.将BMSCs接种到HAp NWs和Tb-HAp NWs膜上,以TCP上接种BMSCs为阴性对照,均进行成骨诱导培养。通过碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)活性和定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)的成骨标志物基因表达来测定体外成骨潜能。2.3.选择等质量的HAp NWs和Tb-HAp NWs膜,并与烧结HAp进行比较。各组中的三个样品分别浸入不同pH值(5.6和7.4)的无菌磷酸盐缓冲溶液(phosphate-buffered solution,PBS)中,在不同时间点收集等体积样品并换新鲜 PBS,采用亚甲蓝法钙检测试剂盒测定各组钙离子释放量。通过电感耦合等离子体发射光谱(Inductively coupled plasma optical emission spectroscopy,ICP-OES)分析测定Tb-HAp NWs组等分样品中的Tb3+和Ca2+离子浓度。3.设计HAp/Tb-HAp CCS膜用于在体内促进骨修复过程的可视化观察。3.1.通过切割镶嵌法合成HAp/Tb-HAp CCS膜,将直径3 mm的Tb-HAp内圆嵌入外径为5 mm、内径为3 mm的HAp外环中,制备HAp/Tb-HAp CCS膜。3.2.选用36只8周龄雄性Wistar成年大鼠,建立直径5 mm的双侧大鼠颅骨缺损模型,右侧放置HAp NWs膜或HAp/Tb-HAp CCS膜,左侧为空白对照。术后取材,将HAp/Tb-HAp组样品置于荧光显微镜下,在470-490 nm激发波长下观察样品的荧光分布情况,并用ImageJ测量相对荧光强度。3.3.通过显微计算机断层扫描(micro computed tomography,Micro-CT)对颅骨进行三维扫描,应用Avatar软件进行三维重建,并使用ImageJ分析缺损区新形成骨组织的质与量。3.4.将颅骨标本制作石蜡切片,行hematoxylin&eosin(H&E)和Masson三色染色,在显微镜下观察缺损区新生骨,并用Image-Pro-plus 6.0软件进行测量。结果:1.成功制备HAp NWs和Tb-HAp NWs膜,XRD图谱证实了所制备的HAp和Tb-HAp纳米晶的晶相,HAp NWs和Tb-HAp NWs均具有典型的HAp衍射峰。FTIR显示HAp NWs和Tb-HAp NWs在3752 cm-1(-OH)和1029 cm-1(PO43-)处拥有HAp的固有峰。SEM结果显示HAp NWs的长度约为200 μm,Tb掺杂后,Tb-HAp NWs的长度约为100μm,因此,Tb掺杂可以降低HAp NWs的长度。HAp NWs和Tb-HAp NWs的宽度都在10nm左右,说明Tb掺杂对NWs的宽度几乎没有影响。在488 nm的激发下,Tb-HAp NWs可以发射543 nm的光。EPMA定量分析得到的Tb/Ca摩尔比为～3%。2.HAp/Tb-HAp CCS膜具有良好生物相容性,显著促进BMSCs的成骨分化并能生物降解。2.1.SEM观察BMSCs与HAp NWs和Tb-HAp NWs之间的粘附稳定,细胞生长良好,有大量伪足;活死细胞染色和CCK8结果显示,与TCP相比,BMSCs在HAp NWs膜和Tb-HAp NWs膜上均表现良好活性。2.2.经成骨诱导7 d后,在HAp NWs膜和Tb-HAp NWs膜上培养的BMSCs的ALP活性比在TCP上培养的BMSCs的ALP活性显著增加(P<0.0001)。成骨诱导7、14 d后,与TCP相比,成骨相关基因骨钙素(osteocalcin,OCN)、骨唾液蛋白(bone sialoprotein,BSP)和ALP在HAp NWs膜和Tb-HAp NWs膜上的表达明显上调(P<0.0001)。2.3.钙检测试剂盒检测结果显示在pH 5.6和7.4的PBS中,Ca2+从HAp NWs膜、Tb-HAp NWs膜和烧结HAp中连续释放,与pH7.4相比,浸泡在pH5.6PBS中的材料降解速率更快。同时,HAp NWs膜和Tb-HAp NWs膜的降解速率明显快于烧结HAp。Tb-HAp NWs膜的ICP-OES分析结果显示,随着Ca2+离子浓度的增加,Tb3+离子浓度在pH 5.6和pH 7.4下均同步增加,说明二者同步释放,证明Tb3+的荧光分布变化可以用来评价HAp在骨修复过程中降解-扩散-重构的行为。3.成功合成HAp/Tb-HAp CCS膜并用于在体内可视化观察HAp在骨修复过程中降解-扩散-重构的行为。3.1.将HAp/Tb-HAp组样品置于激发波长为470-490 nm的荧光显微镜下,初始状态下可以明显观察到荧光Tb-HAp内圆与无荧光HAp外环之间的边界。4 w后,HAp外环可见开始侵入的绿色荧光区,荧光强度在Tb-HAp内圆最强,HAp外环次之,而周围的骨组织无荧光。8w后,HAp外环的荧光强度明显高于4w,HAp外环与骨之间的边界清晰。12 w后,HAp外环的荧光强度与Tb-HAp内圆的荧光强度无明显差异,Tb-HAp内圆与HAp外环之间的边界消失。结果表明,Tb3+逐渐均匀地扩散到整个缺损区,可作为荧光指示剂可视化显示HAp在骨修复过程中的降解-扩散-重构行为。3.2.Micro-CT结果显示植有HAp NWs膜和HAp/Tb-HAp CCS膜的实验组在4、8和12w骨愈合情况明显优于空白对照组,两实验组之间无明显差别。3.3.H&E和Masson三色染色显示,在4、8和 12 w,HAp NWs膜和HAp/Tb-HAp CCS膜组缺损处骨修复的数量和成熟度均明显高于空白对照组。结论:本实验成功制备了由Tb-HAp NWs内圆和HAp NWs外环组成的HAp/Tb-HAp CCS膜,观察了HAp在骨修复过程中降解-扩散-重构的行为。Tb-HAp NWs和HAp NWs两种膜均具有高度的生物相容性,可诱导BMSCs体外成骨分化并能生物降解。大鼠颅骨缺损修复模型显示中心荧光逐渐向外扩散,直至均匀分布于骨缺损区,提示HAp首先降解,然后降解产物扩散,最后重构成新的HAp从而修复骨缺损。此外,Micro-CT和组织学染色分析结果说明Tb的掺杂不影响骨修复过程。因此,本研究为可视化观察HAp在骨修复过程中的降解-扩散-重构行为和评价基于HAp材料的成骨能力提供了一种新的研究方法。