背景和目的:在生物制药领域,蛋白类药物正处在迅猛发展时期。据Drug Bank2017年发布的最新数据表明,有5028种试验药物和4775种非冗余蛋白(如药物靶点、酶、转移介质、药物载体等)序列等待进一步的评估。日益增长的需求使得优化CHO细胞表达系统以高效生产蛋白药物尤为重要。近年来,瞬时表达技术凭借其时间短、费用低、产物符合临床标准的优势,逐渐得到重视和发展。在规模化细胞培养过程中,细胞凋亡与细胞存活状态、产物质量息息相关。因此,通过过表达抗凋亡基因以延缓细胞凋亡、改善细胞生长状态是降低单克隆抗体生产成本的策略之一。此外,据文献报道,影响自噬途径从而延缓细胞死亡也是重要的方法之一。有研究表明,自噬诱导剂rapamycin可以延长CHO细胞存活时间,影响稳定表达抗体的细胞株的产量。anti-PD1单克隆抗体现已被广泛应用于临床,临床上目前证实其可以治疗6种癌症。市场上,已经有三家公司获得FDA批准,可以在市场上销售anti-PD1单克隆抗体。其它追随者也处在对这种抗体的不同的研究发展阶段。故而,以anti-PD1为例,研究提高其表达量的方法具有一定的意义。本文介绍了一种通过共转染瞬时表达抗凋亡基因和目的基因,从而提高目的蛋白anti-PD1抗体(anti-PD1 antibody)瞬时表达量的方法。并探究共用抗凋亡基因Bcl-x L与rapamycin对细胞培养和抗体表达量的影响。方法:(1)通过优化DNA质粒用量,DNA与PEI配比,细胞密度,确定最佳转染条件。并应用此转染条件,检测Bcl-x L和Mcl-1延缓凋亡的效果。(2)通过分别转染5-75%的抗凋亡基因Bcl-x L,Mcl-1,优化在共转染瞬时表达中,抗凋亡基因应用的最佳比例。(3)在125 m L摇瓶培养体系中,分别转染10%Bcl-x L、50%Mcl-1,并在后续培养中持续观察抗凋亡基因对细胞密度、细胞活率、凋亡情况以及anti-PD1单克隆抗体表达量的影响。当细胞活率低于50%时,收取细胞上清,检测表达量。(4)为了探究Bcl-x L和rapamycin共同作用是否可以延长细胞生长时间,在共转染10%Bcl-x L后24 h,加入100 n M rapamycin,并持续观察其对细胞密度、细胞活率、凋亡情况以及anti-PD1单克隆抗体表达量的影响。结果:(1)转染的最佳条件为DNA与PEI的比例为1:3(w/w),DNA用量3.0μg/m L,细胞密度3.0μg/m L。转染Bcl-x L、Mcl-1的CHO细胞凋亡情况明显优于对照组;(2)最佳共转染比例分别是10%的Bcl-x L和50%的Mcl-1。(3)转染抗凋亡基因Bcl-x L组和Mcl-1组同对照组相比,活细胞密度无统计学差异,但同一时间点细胞活率较高,细胞凋亡较少,从而延长细胞培养时间,分别提高82%和34%的单克隆抗体表达量。(4)10%Bcl-x L与100 n M rapamycin的共同作用下,可以明显延缓细胞凋亡,抑制细胞增殖,从而延长细胞存活时间,最后,anti-PD1单克隆抗体表达水平可提高2倍以上。